百合種球脫毒技術研究進展

胡新穎等

摘要：對近年來我國百合種球脫毒技術的研究進展情況進行了綜述，介紹了百合常見病毒種類及特點，系統闡述了我國目前常用的百合種球脫毒技術：愈傷組織培養、莖尖培養、熱處理、抗病毒藥劑應用以及多種方式綜合應用等。

關鍵詞：百合；種球；脫毒；研究進展

中圖分類號： S682.2+65.04 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0006-03

收稿日期：2013-08-12

基金項目：遼寧省農村科技特派團項目（編號：2012215008）。

作者簡介：胡新穎（1980—），女，河北豐潤人，碩士，助理研究員，從事花卉栽培、育種與種球繁育技術研究，E-mail：huxinying2013@163.com。

通信作者：顏范悅，研究員，從事花卉栽培、育種與種球繁育技術研究。E-mail：wl401983@163.com。百合（Lilium spp.）為百合科百合屬多年生球根類草本植物，因其花大、花色豐富、花形優美而深受人們喜愛，是主要的切花觀賞花卉之一。商業上用的百合種球主要以扦插繁殖和分球繁殖等無性繁殖為主。長期的無性繁殖使病毒在百合體內積累，引發病毒病，嚴重影響切花產量和品質。另外，栽培管理不當，導致溫度過高，引發蚜蟲危害，使病毒在百合植株間傳播，種球帶毒率日益增加。采取有效措施控制和消除病毒病，生產優質無毒百合種球，是百合種球商品化生產面臨的一個重要問題。目前百合脫毒主要集中在莖尖培養、熱處理、應用抗病毒藥劑及綜合脫毒等方法，本文就百合的病毒病種類及脫毒技術做一系統的綜述。

1百合常見病毒病的種類及特點

自Stewart（1896）描述百合的壞死條紋以來，相繼報道了百合的病毒病原14種。其中發生普遍，危害嚴重的病毒有5種，即百合潛隱病毒（lily symptomless virus，LSV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、郁金香碎花病毒（tulip breaking virus，TBV）、異名百合斑駁病毒（lily mottle virus，LMoV）和百合叢簇病毒（lily rosette virus，LRV）。其他9種病毒均在栽培地區少量發生，對百合構不成普遍危害[1]。

近年來，隨著百合引種數量的增加、種植面積的擴大，以及不規范的種球自繁，病毒病已開始在我國各百合種植區發生流行，一般發病率為40%～50%，二代種球的帶毒率在90%以上，嚴重制約了我國百合鮮切花的產量和質量。這些病毒在危害百合時有幾個突出特點：多種病毒復合侵染，病癥復雜、危害重，傳播速度快，病毒在植株內分布不均，初侵染與二次侵染特點不同等[2]。病毒病對百合的危害主要有：植株嚴重矮化，脈明，花葉，畸形，壞死斑，鱗莖變小，產量下降，種質明顯退化，開花少且小，有的甚至盲花，嚴重時整株枯死，影響百合的藥用、食用和觀賞價值。

2百合脫毒技術研究現狀

2.1愈傷組織培養脫毒技術

利用百合鱗片、莖尖等外植體誘導愈傷組織，進而誘導分化無毒試管苗或鱗莖，是脫除百合植株體內病毒的一種途徑。據鄭麗娜研究表明，百合鱗片通過誘導出愈傷組織，再分化成帶葉的小鱗莖，經檢測，脫毒率總體偏低，在317%～46.7%之間，此途徑暫不能成為百合脫毒的有效途徑[3]。此外，愈傷組織在長期無性培養過程中，由于培養基中激素、生長素物質的刺激影響，通常會發生體細胞無性系變異，這種變異的范圍和方向都是不定的，因此對于無性繁殖作物而言，為了保持優良性狀，一般不采用此法[4]。但是，這種脫毒方式有其自身的優點，比如，實驗室可行性強、分化率控制性強、周期較短、一次性成苗數量多等，在馬鈴薯、天竺葵、大蒜、草莓等植物上應用已先后獲得成功，在百合上應用此種脫毒方法有進一步研究的價值和空間。

2.2莖尖培養脫毒技術

莖尖培養脫毒是利用病毒在較老的器官和組織內含量較高，在莖尖等幼嫩的或未成熟的組織和器官中含量較低的原理，剝取莖尖組織培養，脫除植株體內病毒。早在1962年，Phillips就利用莖尖培養成功脫除百合病毒。1966年Mori和Hamaya通過莖尖培養獲得了百合無病毒植株。從此，莖尖培養被廣泛應用于生產無毒百合種苗。

通過莖尖培養獲得無病毒植株的難易程度與品種和感染病毒的種類有直接關系。徐品三等利用不同百合品種的不定芽培養證明了這一點，各品種的再生子球中，“香華麗”百合的LSV和TBV檢出率較高，分別是50%和59%，“卡薩布蘭卡”百合中的LSV容易脫去，脫毒率達76%，“魅麗”百合中的CMV能全部脫去。其原因可能是它們生長點附近病毒的濃度、維管束分化程度以及細胞代謝活性不同的緣故[5]。

采用莖尖培養時切取莖尖的大小是研究人員一直在探求的問題。切取莖尖太大，成活率高，但脫毒效果差；切取莖尖太小，脫毒率雖高，但操作不方便。因此，選擇適當的莖尖大小，兼顧成活率和脫毒率2個因素，是成功利用莖尖培養獲得脫毒原種球的關鍵。邵增龍等認為剝取0.2～0.3 mm 的莖尖分生組織進行培養的脫毒效果較好且易成活[6]。張文珠等研究表明，直接剝取0.2～0.5 mm的莖尖，脫毒率達38%[7]。朱旭東等先用鱗片誘導分化不定芽，再利用無菌不定芽剝取0.5 mm以下莖尖進行培養，降低了污染率，提高了成活率且節省了材料，但脫毒效果一般[8]。鐘海豐等認為新鮮百合種球經4 ℃冷藏處理1個月后剝取0.2 mm莖尖培養的脫毒方法，既提高出芽率，也達到了較理想的脫毒率，是百合脫毒的較好方法[9]。綜上所述，莖尖培養切取莖尖的最適大小為0.2～0.5 mm。操作需在解剖鏡下進行。

莖尖二次脫毒是對莖尖培養方法的改進，具有簡便、易掌握、速度快、分化率高、脫毒率高、污染率低等特點。鄭麗娜等一次剝取莖尖0.2～0.4 mm，培養成苗后，剝取無根苗的莖尖（0.4～0.6 mm）進行二次脫毒培養，脫毒率都在75%以上[3]。侯娜研究表明，2～3 mm組培苗莖尖經過1次莖尖培養+4次繼代脫毒處理后，CMV和LSV的脫毒率都能達到100%[10]。

靳慧潔報道的莖尖超低溫脫毒技術[11]是一條新的脫毒途徑。試驗表明，繼代后20 d的百合組培苗，經超低溫處理，在 40 ℃ 水浴化凍后，切取0.5～0.8 mm的莖尖，脫毒率、成活率較高，生長較快，整個操作簡單易行，可達到大規模實際生產的需求。

2.3熱處理與莖尖培養結合的脫毒技術

熱處理是根據病毒在高溫下出現鈍化，其復制明顯減弱或停止，植物在高溫培養期間生長的嫩稍不帶病毒，取其嫩梢進行培養從而達到脫毒的目的。熱處理脫毒法已應用多年，被世界多個國家利用。該項技術要求的設備條件比較簡單，脫毒操作也較容易。主要缺點是脫毒時間長，脫毒不完全，若溫度過高或處理時間太長，又會降低植株的成活率。此外，由于溫度難以控制以及各病毒對溫度的敏感范圍不一樣，很難獲得理想的控制效果。因此，目前百合脫毒技術研究中，熱處理多與莖尖培養脫毒結合應用，能達到較好的脫毒效果。

熱處理與莖尖培養相結合的方式基本有2種：一是先對鱗莖或試管苗進行熱處理，然后切取莖尖檢測脫毒效果，相關研究報道較多。徐品三等以“鐵炮”百合感病種球為材料，對其進行37 ℃熱處理20 d后再進行組織培養，子球再生率僅為40%左右，但LSV脫毒率達95%以上[12]。陳劍勇以“索蚌”小鱗莖為外植體，采用50 ℃熱水處理30 min結合莖尖培養，脫毒率可達80%，直接莖尖培養的脫毒率僅為30%[13]。吳斌等將帶LSV、CMV、LMoV的百合子球放入恒溫箱中，35 ℃ 左右培養4周后病毒含量明顯降低。剝取0.4～0.6 mm莖尖2次脫毒，4個月后組培苗帶毒率降為0%[14]。周曉波等以帶LSV的“卷丹珠”芽為材料，36 ℃處理10 d后，剝取0.2 mm大小的莖尖進行培養，脫毒率達100%[15]。劉芬等研究表明，花絲培養結合37±2 ℃熱處理28 d后，切取0.8～1.0 mm的莖尖再生芽脫毒效果最好，脫毒率達80%以上[16-17]。江洪如等將“龍牙”百合鱗莖在58 ℃處理10～20 min，再在38 ℃溫度下熱處理72 h，結合0.2～0.4 mm莖尖培養，可完全脫去LSV、CMV和LMoV[18]。羅麗萍等以“龍牙”百合組培小鱗莖為試材，白天40～42 ℃、夜晚35 ℃熱處理60 d后，剝取0.2～0.3 mm的莖尖進行培養，成活率和脫毒率都較高[19]。陳麗等將“卷丹”鱗莖經28～30 ℃高溫催芽后，剝取小于0.2 mm的微生長點進行培養，脫毒率達100%[20]。不同的百合品種經熱處理后脫毒效果是有差異的。姜春華對東方系百合的不同品種進行2次遞進熱處理和莖尖脫毒。結果表明，高溫處理的最理想溫度是40～45 ℃，熱處理后剝取0.2～0.6 mm的莖尖進行脫毒培養，“西伯利亞”的脫毒率為100%，吸光度值低，脫毒徹底；“凝星”的脫毒率為100%，但吸光度值高，脫毒不徹底，效果一般[21]。

另一種熱處理方式是先剝取莖尖，再對試管苗進行高溫培養，也能達到較好的脫毒效果。張文珠等以帶毒的Tiber為試材，莖尖培養結合熱處理，脫毒率達60%[7]。劉博剝取帶有LSV病毒的Tiber商品球的莖尖約 2 mm，結合白天 38 ℃ 10 h，夜間32 ℃ 14 h全暗培養，脫毒率達100%[22]。高慧卿等以品種Tiber初代培養的無菌苗為材料，切取0.2～0.5 mm的莖尖結合65 ℃熱處理30 min再進行脫毒培養，LSV的脫毒效果優于莖尖培養[23]。張藝萍等將帶有CMV的Siberia組培苗經（39±1） ℃熱處理后，2次剝取0.4～0.6 mm的莖尖培養，脫毒率可達80%[24]。

熱處理與莖尖培養相結合之所以能夠提高脫毒效果，是由于熱處理可使植物生長本身所具有的頂端免疫區得以擴大，有利于切取較大的莖尖，從而提高組織培養的成活率[3]。先對鱗莖進行熱處理再莖尖脫毒的方式，在切取莖尖大小相同的情況下，更有利于提高試管苗的成活率，更適合大規模脫毒原種球的生產。

2.4熱處理+莖尖培養+抗病毒藥劑綜合脫毒技術

化學療法即抗病毒藥劑處理，是一種新的脫毒方法，在外植體培養時添加抑制植物病毒活性的化學物質，如病毒唑（virazole ）或硫尿嘧啶（2-thiouracil）等，以達到減輕病毒危害的目的。其作用原理是：抗病毒藥劑在三磷酸狀態下會阻止病毒RNA帽子結構形成，抑制病毒增殖或移動。徐品三等研究表明，將檢測出LSV的“卡薩布蘭卡”鱗片組培形成的不定芽，移植在添加DHT的液體培養基上培養，2周后轉接到固體培養基中，經檢測脫毒率達到100%[5]。

單獨應用抗病毒藥劑脫除百合病毒也較少見，一般都是與莖尖培養、熱處理相結合應用，脫毒效果較好。徐榕雪試驗表明，病毒唑處理濃度為4 mg/L，莖尖大小為 0.5～0.7 mm，能保證較高的成活率和脫毒率，且操作簡便、成苗快[25]。王超等研究表明，種球38 ℃光照處理 16 h，25 ℃ 黑暗處理 8 h，待地上部分長出10 cm左右高時，切取0.5～0.8 mm莖尖，接種于含病毒唑10 mg/L的培養基中，脫毒效果最好[26]。鄭麗娜等對種球做相同熱處理，再剝取 0.8～1.2 mm 莖尖，置于含6 mg/mL病毒唑的培養基中培養15 d，脫毒效果最佳，一次性脫毒率可達到80%以上[27]。張惠華等以2～4 ℃冷庫休眠84 d、15 ℃室內7 d催芽處理后的“索蚌”種球為試材，在39 ℃（±1 ℃）恒溫處理15 d，剝取莖尖大小為0.4～0.5 mm，病毒唑處理濃度為 10 mg/L 時，脫除病毒效果最好[28]。馬平霞研究表明，2～3 cm的試管苗放入38 ℃ 16 h光照和25 ℃ 8 h黑暗的培養箱中熱處理42 d后，切取莖尖0.3～0.5 mm，接種于含5 mg/L病毒唑的分化培養基上，脫毒率最高達67.5%[29]。

綜上所述，單一的脫毒處理技術難以完全脫除病毒，或需要較長的時間，熱處理+莖尖培養+抗病毒藥劑的綜合脫毒技術是目前生產無毒百合種球最佳的途徑。