氨氮降解菌的分離、鑒定及降解效果初步研究

苗 苗,王繼華，楊雪辰，陳黛慈，杜 雪

(哈爾濱師范大學 生命科學與技術學院，哈爾濱 150025)

氨氮降解菌的分離、鑒定及降解效果初步研究

苗 苗,王繼華*，楊雪辰，陳黛慈，杜 雪

(哈爾濱師范大學 生命科學與技術學院，哈爾濱 150025)

以(NH4)2SO4為唯一氮源的培養基中，從活性污泥中分離篩選出8株具有氨氮降解能力的菌株，根據各菌株之間降解率及生長情況的比較，從中篩選出1株對氨氮降解效果較為明顯的菌株NX3，經形態學和生理特性初步鑒定其為芽孢桿菌屬(Bacillus)，分別測定了在不同的氨氮初始濃度、pH值、溫度下菌株NX3對培養基中氨氮的降解效果，實驗結果表明在初始氨氮質量濃度300 mg/L、pH值7.0、溫度30 ℃時，該菌株對氨氮降解效果較好，降解率為45.53%。

活性污泥；氨氮降解菌；降解效果

氨氮是水相環境中氮的主要形態，是造成水體富營養化的主要污染物，氨氮的含量是衡量污水污染程度的一個重要指標。2011年監測的26個重點湖庫中，包括滇池、密云水庫、千島湖和石門水庫等，其主要污染指標為氨氮、化學需氧量和生化五日需氧量，許多湖泊處于不同程度的富營養化狀態[1]。海洋局召開2012年海洋環境公報新聞發布會指出，全海域共發現赤潮73次，累計面積 7 971 km2。赤潮發現次數為近5 a最多。因此，水污染已經成為一個迫在眉睫的問題，雖然目前我國在水污染防治方面做了很多工作，但是氮素仍是造成水污染的主要原因之一，近年來，國內外對氨氮廢水處理方面開展了較多研究。其中生物脫氮技術備受關注，生物脫氮是利用從自然界中獲得的有益微生物降低氨氮，生物脫氮以其無污染、經濟和安全等優點被認為是目前最經濟有效、最有前途的水體除氮方法，相關研究也備受重視[2-3]。氨氮降解菌是生物脫氮技術的關鍵，因此本文從活性污泥中分離篩選出1株具有較好氨氮降解能力的菌株，研究了初始氨氮的質量濃度、pH值、溫度對菌株氨氮降解效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

污泥：本實驗所用菌種是從哈爾濱某污水處理廠活性污泥中篩選分離得到的。

LB培養基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，水定容至1 000 mL，pH 值7.0(LB固體培養基為加2%瓊脂)；篩選培養基：葡萄糖5.0 g，(NH4)2SO42.0 g，NaCl 1.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH值7.2～7.4，水定容至1 000 mL；分離培養基：篩選培養基加2%瓊脂；選擇培養基：葡萄糖5.0 g，(NH4)2SO40.225 g，NaCl 1.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，pH 值7.2～7.4，水定容至1 000 mL(初始氨氮質量濃度約為50 mg/L) ；馴化培養基：在篩選培養基氨氮濃度基礎上，不斷提高氨氮濃度；模擬氨氮污水：(NH4)2SO40.47 g，NaC1 1.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，微量鹽1 mL[4]，水定容至1 000 mL(模擬氨氮污水中氨氮的初始質量濃度為100 mg/L)。

菌懸液的制備：將至少經過2次連續活化的菌株接種到裝有葡萄糖蛋白胨液體培養基100 mL的三角瓶中，并在紫外可見分光光度計420 nm波長處測定其吸光度，用葡萄糖蛋白胨液體調整質量濃度，使其 OD420= 0.3, 作為菌懸液[5-6]。

1.2 方法

1.2.1 氨氮降解菌的分離與篩選

菌株的分離和純化。取5 g活性污泥加入裝有45 mL無菌水的內置玻璃珠的錐形瓶中稀釋混勻，振蕩培養1 h，使菌膠團充分打散，從中取0.1 mL菌液經梯度稀釋涂布于LB培養基平板上，在37 ℃培養箱中培養2～3 d后，在平板上挑選出不同形態的單菌落編號并反復劃線進行多次分離純化，直至得到純培養物，最后將純化后的各菌株轉至斜面保存。

氨氮降解菌的篩選與馴化。將純化所得各菌株接種至篩選培養基，置37 ℃、120 r/min振蕩培養5～7 d后，從中選取渾濁度相對較高的作為初篩試驗菌，取各初篩試驗菌液0.1 mL，分別涂布至分離培養基中，將分離出的各初篩試驗菌接種至馴化培養基，對初篩菌進行不斷馴化，最終得到試驗菌株。

1.2.2 氨氮降解菌的生長曲線測定

將菌株接種到選擇培養基振蕩培養，每隔2 h取樣，在紫外可見分光光度計600 nm波長下測定其光密度(OD)值，并繪制光密度(OD)值與培養時間的關系曲線。

1.2.3 環境因素對氨氮降解菌的降解效果的影響

將菌種分別接種至裝有40 mL篩選培養基的100 mL錐形瓶中，分別在不同溫度(25、30、35、40、45 ℃)、不同pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)和不同氨氮初始濃度(50、100、200、300、400 mg/L)條件下進行單因素試驗，測定培養基中殘余氨氮質量濃度，計算氨氮的降解率，確定反應的溫度、pH值、氨氮初始濃度對菌株降解氨氮效果的影響。

1.2.4 降解效果的測定方法

吸取10 mL菌懸液，2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，再用10 mL生理鹽水洗滌沉淀，混勻，再次離心，如此重復3次，以除去菌種活化過程中產生的氨氮[7]。用10 mL生理鹽水清洗沉淀，最后制成氨氮降解菌種液，按10%的接種量將菌種液接入裝有40 mL選擇培養基的100 mL錐形瓶中，于120 r/min搖床振蕩培養48 h后，經2 000 r/min 離心10 min，取上清液測殘余氨氮濃度并與未接種菌株的空白培養基作對比，測定培養液中氨態氮含量[8]，計算出氨氮降解率。

氨氮的測定: 采用納氏試劑分光光度法[9]進行。

1.2.5 氨氮降解菌株NX3的初步鑒定

氨氮降解菌NX3經細胞形態和個體菌落形態的觀察、生長特征及生理生化特征，具體參照文獻[10-11]進行初步鑒定。

2 結果與分析

2.1 氨氮降解菌的分離與篩選結果

從哈爾濱某污水處理廠二沉池采集的污泥，經富集、分離、純化，共獲得26株菌。將純化所得26株菌經篩選與馴化后，最終得到8株菌，編號分別為：NX3、NX6、NX10-1、NX11-1、NX11-2、NX13-1、NX13-2、NX24。8株菌的主要特征見表1。將這8株菌按10%的接種量，接入到模擬氨氮污水中，于37 ℃、120 r/min條件下培養24～48 h后，計算8株菌的氨氮降解率，結果見圖1。并測定這8株菌在以(NH4)2SO4為唯一氮源的無機鹽培養基中的生長曲線，結果見圖2。最后通過8株菌的降解率結果及在以(NH4)2SO4為唯一氮源的無機鹽培養基中的生長情況，綜合比較選擇出1株在篩選培養基中生長速度較快、相對氨氮降解率較高的NX3菌株進一步試驗。

表1 8株氨氮降解菌的主要特征

圖1 8株菌的氨氮降解率Fig.1 Degradation rate of eight bacterias

圖2 8株菌的生長曲線Fig.2 Growth curve of eight bacterias

為進一步提高NX3菌株降解氨氮的能力，從處理溫度、反應的pH值及初始氨氮質量濃度3個方面的環境因素進行優化分析。

2.2 環境因素對菌株降解效果的影響

2.2.1 處理溫度對氨氮降解效果的影響

溫度是影響微生物生長與代謝的重要環境因素之一，同時也是影響生物脫氮的重要原因。吸取NX3菌的菌種液，實驗按10%的接種量，分別接種到預先配置初始氨氮質量濃度為100 mg/L的選擇培養基中，然后分別置于溫度為25、30、35、40、45 ℃，120 r/min搖床振蕩培養，48 h后測定培養基中殘余的氨氮濃度，計算相應的氨氮降解率，繪制氨氮降解率與反應溫度的曲線，結果見圖3。由圖3可見在選擇培養基中隨著反應溫度的升高，曲線呈現上升趨勢，氨氮降解率有所增加，在30 ℃時達到最大值，但隨著溫度進一步升高，氨氮降解率反而下降?？赡苡捎谖⑸锂a生的酶具有最適溫度，酶的活性在一定溫度范圍內是隨溫度升高而增加的，但當溫度超過這個最適溫度后，酶活就會逐漸降低，酶甚至出現失活，相應的酶所催化的酶促反應速率也將隨之下降。因此NX3菌株適宜溫度為30 ℃。

圖3 處理溫度對氨氮降解效果的影響 Fig.3 Effect of temperature on ammonia nitrogen removal

2.2.2 反應pH值對氨氮降解效果的影響

將初始氨氮濃度為100 mg/L的選擇培養基的pH值分別調至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。吸取NX3菌的菌種液，實驗按10%的接種量，分別接種至配置好的選擇培養基中，在30 ℃、120 r/min的條件下搖床振蕩培養48 h后，測定培養基中殘余的氨氮質量濃度，計算相應pH值下氨氮的降解率，并繪制出氨氮降解率與pH值的關系曲線，結果見圖4。由圖4可見隨著選擇培養基中pH值的逐漸升高，菌株對氨氮的降解率呈現上升趨勢，pH值在7.0時，氨氮降解率達到最大值為35.70%，隨后曲線呈現逐漸下降趨勢。這可能由于外界環境中氫離子的濃度超過或低于微生物酶的一定的適應范圍，而引起該種微生物原生質膜的電荷發生變化，影響微生物對營養物質的吸收及其酶的活性，進而影響酶促反應的速率，從而影響微生物的代謝。因此在考慮初始時菌株的生長需要，反應的pH值應控制在7.0左右為宜。

圖4 反應pH值對氨氮降解效果的影響Fig.4 Effect of pH on ammonia nitrogen removal

2.2.3 初始氨氮質量濃度對氨氮降解效果的影響

當污水中氨氮濃度過高時，氨氮降解菌及其他細菌的生長會受到抑制甚至停止，從而影響其對氨氮的降解[12]。分別配制氨氮初始含量為50、100、200、300、400 mg/L的選擇培養基，反應的pH值調節至7.0，將NX3接種至上述培養基中，在30 ℃、120 r/min條件下搖床振蕩培養，48 h后測定選擇培養基中的殘余氨氮質量濃度，計算出相應的氨氮降解率，并繪制氨氮降解率與氨氮初始質量濃度的關系曲線，結果見圖5。培養基的氨氮質量濃度在50～200 mg/L時，曲線呈現明顯的上升趨勢，說明隨著培養基中初始氨氮質量濃度逐漸升高，其菌株對氨氮的降解率也隨之升高；初始氨氮質量濃度在300 mg/L時降解率達到最大為45.43%；當初始氨氮的質量濃度高于300 mg/L時，曲線呈現下降趨勢，表示隨著初始氨氮質量濃度的升高，該菌株對氨氮的降解率呈現出下降趨勢。菌株NX3的不同初始氨氮質量濃度影響的實驗結果表明，當初始氨氮質量濃度較高時，其氨氮降解效果較為明顯，說明此時環境中的營養對NX3菌的生長較為適宜，而初始氨氮質量濃度過高時，會對菌株NX3的生長產生一定的抑制作用，導致菌株對氨氮的降解率下降，因此，氨氮降解菌NX3適宜的氨氮初始質量濃度為300 mg/L。

圖5 初始氨氮質量濃度對氨氮降解效果的影響Fig.5 Effect of ammonia nitrogen beginning concentration on its removal

2.3 NX3菌株的初步鑒定

菌株NX3菌落為中央白，邊緣呈透明，邊緣鋸齒狀；菌體為桿狀菌，有芽孢、無莢膜，無鞭毛，革蘭氏染色結果為革蘭氏陽性；NX3菌株生理生化實驗，結果見表2，根據文獻[10-11]初步鑒定，這些特征均符合芽孢桿菌屬(Bacillus)的特征。

表2 NX3的生理生化特性

注：“+” 代表陽性；“-”代表陰性。

3 結 論

通過對活性污泥中微生物的分離與純化，以硫酸銨為唯一氮源篩選得到1株對氨氮具有較好降解作用的菌株NX3，經鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)，是一類具有重要的環境修復意義的微生物。選擇NX3菌為研究菌種，進一步測定氨氮降解的影響因素?？疾炝颂幚頊囟?、pH值、初始氨氮質量濃度對該菌株氨氮降解效果的影響，研究結果表明當溫度為30 ℃，pH值為7.0，初始氨氮質量濃度為300 mg/L時，該菌株對氨氮的降解效果較好，氨氮降解率為45.43%。因此應用該微生物降解污水中的氨氮，改善環境是可行的。

[1]Ministry of Environmental protection of the People's Republic of China,China environmental state bulletin in 2011[J/OL]. http://jcs.mep.gov.cn/hjzl/zkgb/2011zkgb

(中華人民共和國環境保護部,2011年中國環境狀況公報)

[2]李 帆,莢 榮,查 誠.脫氮菌株P6的分離鑒定及其處理氮氮廢水的試驗研究[J].生物技術,2007,17(5):64-68.

Li F,Jia R,Zha C.Experimental study on isolation and identification of nitrogen removal of nitrogen in wastewater treatment of strain P6[J].Biotechnology,2007,17(5):64-68.(in Chinese)

[3]Moreno B,Gomez M A,Gonzalez-Lopez J,et al.Inoculation of a submerged filter for biological denitrification of nitrate polluted groundwater:a comparative study[J]. Hazard Mater,2005,117(2-3):141-147.

[4]Kim J K,Park K J,Cho K S,et al.Aerobic nitrification-denitri-fieation by heterotrophic Bacillus strains[J].Bioresource Technology,2005,96:1 897-1 906.[5]朱 偉,李 娜.高效氨氮降解菌的篩選鑒定及降解能力測定[J].安徽農業科學,2008,32(22):9 361-9 362.

Zhu W,Li N.Screening and identification on high effective microorganisms degrading ammonia-nitrogen and determination on its degradation ability[J].Journal of An hui Agri. Sci. 2008,36(22):9 361-9 362.(in Chinese)

[6]Miyahara M,Kim S-W,Fushinobu S,et al.Potential of aerobic denitrification by Pseudomonas stutzeri TR2 to reduce nitrous oxide emissions from wastewater treatment plants[J].Applied and Environmental Microbiology,2010,76(14):4 619-4 625.

[7]易 弋,容元平,程謙偉,等.養殖水體氨氮降解菌的分離和初步鑒定[J].貴州農業科學,2011,39(2):154-157.

Yi Y,Rong Y P,Cheng Q W,et al.Isolation and identification of ammonia nitrogen degradation strains from aquaculture water[J].Guizhou Agricultural Sciences,2011,39(2):154-157.(in Chinese)

[8]蔡鈺穎,商 平,魏麗娜,等.氨氮降解微生物菌株的分離篩選及去除效果初步研究[J].凈水技 術,2008,27(3):44-47.

Ca Y Y,Shang P,Wei L N,et al.Pilot study on separ ation selection and removal effect of ammonia nitrogen bacterium[J].Water Purification Technology,2008,27(3):44-47.(in Chinese)

[9] 國家環境保護總局《水和廢水監測分析方法》編委會.水和廢水監測分析方法:第4版[M].北京:中國環境科學出版社,2009:133-136.

The editorial board for monitoring and analysis methods of water and wastewater of State Environmental Protection administration.Monitoring and analysis methods of water and wastewater(4th edition)[M]. Beijing:China Environmental Science Press,2009:133-136.(in Chinese)

[10]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001.

Dong X Z,Cai M Y.The manual of systematic methods of determinative bacteria[M].Beijing:Science Press,2001.(in Chinese)

[11]R.E.布坎南,N.E.吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊:第8版[M].北京：科學出版社，1984.

Buchanan R E,Gibbons N E.Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology(8th edition)[M].Beijing:Science Press,1984.(in Chinese)

[12]Joo H S,Mitsuyo H,Makoto S. Improvement in ammonium removal eficiency in wastewater treatment by mixed culture of Alcaligenes faecal is No.4 and L1[J].J Biosci Bioeng,2007,103:66-73.

Isolation, identification and degradation of ammonia nitrogen degradating bacterium

MIAO Miao, WANG Ji-Hua*, YANG Xue-Chen, CHEN Dai-Ci, DU Xue

(Life Science and Technology College, Harbin Normal University, Harbin, 150025, China)

(NH4)2SO4as the sole nitrogen source medium, isolated eight strains with the ability to degrade ammonia from activated sludge screening,a high effective microorganism named NX3 in degrading ammonia-nitrogen was obtained after comparison of degrading rate and growth among the various strains.The strain was initial identified asBacillus, then utilized the biomass to test the optimal conditions of growth.Experimental results show that the ammonia-nitrogen could be degraded 45.53% when the strain was 30℃, with the initial concentration at about 300 mg/L, and pH value was about 7.0.

activated sludge; ammonia degradating bacteria; degradation

10.13524/j.2095-008x.2014.01.013

2013-10-21

黑龍江省教育廳科學技術研究重點項目(12521Z010);哈爾濱師范大學大學生實踐創新基金項目(Sj060803)；黑龍江省研究生創新科研資金項目(YJSCX2012-190HLJ)

苗 苗(1990-)，女，黑龍江雙鴨山人，碩士研究生，研究方向：微生物遺傳，E-mail：272728361@qq.com;*通訊作者：王繼華(1972-)，女，黑龍江慶安人，教授，研究方向：微生物遺傳學、環境微生物，E-mail：wangjihua333@hotmail.com。

Q93

A

2095-008X(2014)01-0059-05