UPLC－MS／MS法同時測定川黃口服液中的5種有效成分

岑衛健，朱平川，范曉蘇，莫琪紅

（1.亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室（廣西大學），廣西 南寧530004；

2.廣西大學化學化工學院，廣西 南寧530004；3.廣西大學生命科學與技術學院，廣西 南寧530004）

0 引言

川黃口服液是由丹參、制何首烏、黨參、黃芪、枸杞子、杜仲、當歸、川芎、蛤蚧、蘄蛇、海龍12味中藥材研制而成的復方口服液，具有益氣養血、滋補肝腎，活血化瘀.能改善氣血兩虛，肝腎不足所致的神疲乏力，頭暈目眩，腰膝酸軟等癥.對免疫功能低下、放化療后白細胞減少及高脂血癥等有輔助治療作用［1］.已有文獻報道采用毛細管電泳法［2］、高效液相色譜法［3-5］、反相液相色譜法［6］測定香丹注射液中原兒茶醛，丹參中原兒茶醛，當歸補血湯中黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ，活血安痛酒中隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量.在川黃口服液原質量標準中，只有性狀鑒別檢查和正丁醇、原兒茶醛的定量檢查方法，目前尚少見有文獻報道對川黃口服液中其他有效成分的測定.

利用超高效液相色譜-串聯質譜檢測法（UPLC-MS／MS），可以較好地分離分析中藥口服液中的復雜成分［7-8］.本文中運用UPLC-MS／MS建立了同時測定益氣養血口服液中的原兒茶醛、黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA 5種有效成分含量的分析方法，該方法具有簡單、快速、準確、高靈敏度等優點，可以用于實際的樣品分析，為藥物質量控制提供依據.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑 超高效液相色譜-三重四極桿質譜系統6460（美國Agilent公司），數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），電子天平（德國Sartorius），超純水儀（美國Millipore公司）.原兒茶醛對照品（批號：中國藥品生物制品檢定所），黃芪甲苷對照品（批號：中國藥品生物制品檢定所），黃芪皂苷Ⅱ對照品（批號：中國藥品生物制品檢定所），隱丹參酮對照品（批號：中國藥品生物制品檢定所），丹參酮ⅡA對照品（批號：中國藥品生物制品檢定所），甲醇、乙腈（色譜純，Themro Fisher公司），甲酸（分析純，廣東光華化學廠有限公司），水（超純水，實驗室自制）.川黃口服液（批號分別為：1207308、1209183、1301242，四川升和藥業股份有限公司）

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的配制 準確稱取5種對照品各10.0mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并加至刻度，搖勻，經0.22μm的微孔過濾膜過濾，對照品儲備液的質量濃度為1.00g／L，在4℃下保存備用，使用前用甲醇稀釋到所需的濃度.

1.2.2 供試品溶液的配制 準確量取益氣養血口服液5mL，置于5mL的EP管中，于12 000r／min下離心10min，將上清液置于另一5mL的EP管中，經0.22μm的微孔過濾膜過濾備用.

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18（50mm×2.1mm，1.8μm），流動相：A相為乙腈溶液，B相為含0.1%甲酸的水溶液；流速：0.35mL／min；進樣量：1μL；梯度洗脫程序：0～5min，90%～80%B；5～6min，80%～60%B；6～16min，60%～30%B；16～20mim，30%～0%B；20～24mim，0%～90%B.

1.2.4 質譜條件 采用電噴霧電離源（ESI）正離子和負離子模式，多重反應監測模式（MRM模式）.霧化氣：氮氣，壓力是2.8×105Pa；鞘氣：氮氣，溫度是360℃，流速是12L／min.干燥氣：氮氣，溫度是350℃，流速是10L／min.毛細管的電壓：4 000V，噴嘴電壓：0V.5種目標組分的其他質譜分析參數見表1.

表1 5種成分的部分質譜分析參數

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇 文中考察了乙腈-水和甲醇-水兩種流動相體系，實驗結果表明使用乙腈-水體系作為流動相5種成分分離良好且峰形對稱，而使用甲醇-水作為流動相時，黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA4種物質的色譜峰主要集中在16～17min，無法得到有效分離.在此基礎上，進一步比較5種物質在不同濃度甲酸水（0.1%，0.2%，0.3%）條件下的靈敏度，結果表明，0.1%甲酸水最有利于提高靈敏度.

2.2 質譜條件的選擇 文中分別采用了正離子和負離子檢測模式，結果顯示，黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA，在負離子模式下檢測不到，而在正離子模式下靈敏度較高，原兒茶醛在負離子模式下的靈敏度比在正離子模式下的靈敏度高.

2.3 線性關系考察 精密吸取5種對照品的儲備液，甲醇溶液稀釋，配制一系列不同質量濃度的對照品，混 合，在 “1.2.3”和“1.2.4”的實驗條件下測定，重復3次.以被測組分質量濃度為橫坐標，峰面積的平均值為縱坐標進行線性回歸分析，具體數據見表2.

表2 5種組分的線性方程、相關系數及線性范圍

2.4 精密度試驗 同一批次待測樣品，按“1.2.2”制備供試樣品，在“1.2.3”和“1.2.4”的實驗條件下連續進樣分析6次，根據色譜峰面積計算相對標準偏差（RSD），結果見表3.結果顯示，該方法有較良好的精密度.

化合物 精密度／% 穩定性／% 重復性／%0.93 0.83 0.88黃芪甲苷 0.68 0.86 1.2黃芪皂苷Ⅱ 0.81 0.56 0.69隱丹參酮 0.95 0.91 1.1丹參酮Ⅱ原兒茶醛A 0.79 0.54 0.47

2.5 穩定性試驗 同一批次待測樣品隨機取6份，按“1.2.2”制備供試樣品，在“1.2.3”和“1.2.4”的實驗條件下測定，分別于0、2、4、8、12h進樣測定，根據色譜峰面積計算相對標準偏差（RSD），結果表明供試樣品在12h內穩定性良好，結果見表3.

2.6 重復性試驗 同一批次待測樣品隨機取6份，按“1.2.2”條制備供試樣品，在“1.2.3”和“1.2.4”條的實驗條件下測定，根據色譜峰面積計算相對標準偏差（RSD），結果見表3.結果表明供試樣品重復性良好.

2.7 加樣回收率試驗 分別精密量取已知這5種組分含量的同一批次川黃口服液各1mL，共9份，每組3份，加入高、中、低3個質量濃度的混合標準品.按“1.2.2”條制備供試樣品，在“1.2.3”和“1.2.4”條的實驗條件下連續測定6次，分別計算回收率，結果見表4.

表4 5種組分在樣品中的加標回收率（n＝3）

續表4

2.8 樣品含量測定 分別精密量取不同批號的樣品，按“1.2.2”條方法制備供試樣品，在“1.2.3”和“1.2.4”實驗條件下連續測定6次.將各組分的峰面積代入回歸方程，結果見表5，對照品及樣品的分離情況見圖1.

圖1 對照品（A）和樣品（B）的UPLC-MS／MS色譜圖

3 結論

采用UPLC-MS／MS技術建立了同時測定川黃口服液中丹參酮ⅡA，隱丹參酮、黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ、原兒茶醛5種藥效成分含量的分析方法.實驗結果表明，該方法靈敏度好、定量能力強、準確度高、快速、簡單.該方法的建立有利于進一步完善川黃口服液及其類方的質量控制及藥代動力學、藥物療效等相關研究.

表5 樣品含量結果 mg／L

［1］王保磊.川黃口服液治療白細胞減少癥19例［J］.中國醫藥指南，2010，4（8）：96.

［2］蔡梅，趙陸華，胡昌勤，等.高效毛細管電泳法測定香丹注射液中丹參素和原兒茶醛的含量［J］.中國藥科大學學報，2001，32（2）：130-132.

［3］黃敬群，張秀巧，郭軍，等.高效液相色譜法測定5種不同產地丹參中丹參素和原兒茶醛含量［J］.安徽中醫學院學報，2005，24（1）：37-40.

［4］高建，夏泉，黃趙剛，等.HPLC-ELSD同時測定當歸補血總苷中黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ［J］.中成藥，2012，34（2）：268-272.

［5］黃開顏，戴冰，周新蓓.HPLC法測定活血安痛酒中隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量［J］.中國醫藥導報，2010，7（34）：42-46.

［6］靖會，楊黎彬，邊軍昌，等.RP-HPLC法測定丹參不同部位中丹參素和原兒茶醛的含量［J］.安徽醫藥，2011，15（6）：691-692.

［7］徐遠金，許桂蘋.高效液相色譜-質譜法測定性保健品中脫水嗎啡、西地那非、前列地爾［J］.色譜，2005，23（6）：633-635.

［8］劉瑩，韓深，馮騫.超高效液相色譜-電噴霧三重四極桿質譜法測定中藥中馬兜鈴酸A和B的含量［J］.色譜，2011，29（11）：1076-1081.