魚類性別決定及分化相關基因研究進展

路暢+蘇利娜+朱邦科

摘要：綜述了Sox、DMRT、芳香化酶、FTZ-F1、FOXL2、Pod1、GSDF、Fanconi anemia/BRCA等一些與魚類性別決定及分化相關的基因的研究動態與進展。旨在為系統研究魚類性別決定機制提供參考。

關鍵詞：魚類；性別決定基因；Sox；DMRT；芳香化酶基因；FOXL2

中圖分類號：S965；Q132.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）13-2981-05

Advances on the Genes Related with Sex Determination and Differentiation of Fish

LU Chang1， 2，SU Li-na1，ZHU Bang-ke2

（1.College of Fisheries， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China；

2. Faculty of Marine Sciences， Ningbo University， Ningbo 315211， Zhejiang， China）

Abstract： The trends and progresses of studying some sex determination and differentiation related genes of fish including Sox，DMRT， aromatase，FTZ-F1，FOXL2， Pod1，GSDF and Fanconi anemia/BRCA were reviewed to provide a reference for understanding mechanism of sex determination in fish.

Key words： fish； sex determination gene； Sox； DMRT； aromatase gene； FOXL2

魚類是脊椎動物中最低等但卻是分布最廣、種類最多的一類生物。魚類在進化上比較原始，與高等脊椎動物相比，其性別決定的遺傳力較小。魚類的性別發育以遺傳因素為基礎，并受到外界環境和自身內分泌調節的影響，是三者相互作用的結果，因此魚類的性別決定機制復雜多變，而且沒有一個普遍的模式。魚類中存在從雌雄同體到雌雄異體，從遺傳決定型到環境決定型的各種性別決定類型，性逆轉在魚類中也是較為常見的現象，基本上具有所有脊椎動物的性別決定方式，因此魚類是一個極好的研究性別決定機制進化的模型。

了解魚類性別決定特點對于研究者尋找魚類性別決定相關基因及性染色體有很大的幫助。魚類的性染色體組成形式多樣，且其性染色體的出現與否及性染色體的種類與它們的系統進化地位無關，在親緣關系較近的種類中，可能會具有完全不同的性染色體類型，如尼羅非魚（Tilapianilotica）為XX/XY型，而奧利亞羅非魚（Tilapia aureus）為ZW/ZZ型[1]。據統計資料顯示，在所研究的魚類中，僅有10%左右的魚類具有異型性染色體，只在個別魚類中，如青鳉（Oryzias latipes）[2]已鑒定出性別決定候選基因DMY，可以認為其性別是由性別決定基因控制的。但大多數魚的性別決定基因還有待探尋和證實。

魚類性別決定的研究主要集中在與性別相關的基因上，如Sox9基因、DMRT1基因、芳香化酶基因、FTZ-F1基因等，近20年來有關魚類性別決定與分化機理及性別相關基因的研究已取得了很大的進展。本文將對近年來在魚類性別相關基因方面所做的研究進行較為系統的綜述。

1 與魚類性別決定相關的基因

1.1 SRY、ZFY、HOX

SRY（Sex-determining region of the Y）是1990年Sinclair等[3]在人類Y染色體上克隆到的一個單拷貝基因，被認為是雄性哺乳動物性別決定的最佳候選基因。目前，已在黃鱔（Monopterus albus）[4]、斑馬魚（Danio rerio）[5]、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）[6]等魚中發現了SRY的同源片段，但該同源片段在雌雄個體中都存在且無差異。

ZFY基因（Zine finger Y gene，ZFY）位于Y染色體上，是一個較強的轉錄激活因子，與精子的形成與發生相關。戢福云等[7]在黃鱔基因組中檢測出1條能與ZFY探針雜交的512 bp DNA片段，并將該片段定位到黃鱔的1號染色體上，在珊瑚魚（Anthias squamipinnis）[8]和斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）[9]中也找到了能與ZFY探針發生特異雜交的片段，但在雌雄個體中無差異。

HOX（Homeobox genes）是一組參與動物早期胚胎發育十分關鍵的基因。付元帥等[10]在對4種魚央屬魚的研究中發現，這4種魚的HOX基因同源序列均無性別特異性，也無種間和亞種間特異性。

SRY、ZFY和HOX是與哺乳類、鳥類及某些爬行類性別決定相關的基因，在魚類中發現了它們的同源片段，但與魚類性別決定的相關性不大。在性染色體及性別決定機制上，魚類與其他脊椎動物有很大的不同，這可能與其進化速度及生長環境條件的不同有關。

1.2 Sox基因家族

由于SRY產物具有高度保守的HMG（High mobility group box）序列，被統稱為Sox（SRY-Related HMG Box）基因家族，其編碼的蛋白質可以與特定的DNA序列結合，是一類重要的轉錄調控因子。迄今為止，在包括魚類在內的脊椎動物中至少發現了40種Sox基因，但與魚類性別決定相關的主要有Sox9、Sox8、Sox3等。

Sox9是緊靠SRY基因的下游基因，被認為是哺乳動物SRY僅有的直接調節的目標基因，在SRY基因表達后被激活，且出現雄性率特異性升高的現象。Sox9基因在硬骨魚類中也有類似的作用，可促進精巢發育，其表達主要在精子細胞附近。在幾種魚類生殖腺分化的早期，已報道了關于Sox9基因的不完全性別二態性類型和在雌性個體中存在Sox9基因的表達，這些說明了Sox9在性別決定和性別分化的早期不起主要作用，但它可能參與生精小管后期的發育。Dong等[11]發現半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）Sox9a基因在雄性的腦、垂體和性腺中的表達都顯著高于雌性，而且Sox9a在9月齡的半滑舌鰨精巢中的表達量達到高峰，并且在原腸胚期的表達量高于其他時期，這說明Sox9a基因對半滑舌鰨的腦-垂體-性腺軸及精原細胞的形成起重要的作用。在鯉（Cyprinus carpio）[12]、奧利亞羅非魚[13]等硬骨魚類中克隆并鑒定出了Sox9基因，但其是否與魚類性別相關有待驗證。Sox8是繼Sox9之后發現的，它與Sox9有相似的功能，可以替代Sox9的部分功能，但是與Sox9的功能強度相比弱了些[14]。

XX/XY型性別決定的生物中Sox3基因位于X染色體上。姚波等[15]對斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）Sox3基因時空表達的研究證實了Sox3基因在中樞神經系統的發育、卵巢發生和功能維持上有重要作用。Zhou等[16]在對雌雄同體魚的研究中發現Sox3在精原細胞中表達，但 Sox3繼續表達，精原細胞的Sox3陽性向卵原細胞、卵母細胞發育。相反，如果Sox3停止表達，精原細胞的Sox3陽性則向精子發生發展。因此，Sox3作為一個轉錄因子，在卵子發生過程中起的作用比精子發生過程還要大。

Sox基因家族中與性別相關的基因在不同種類魚中起不同的作用，甚至是相反的作用，Sox8、Sox9對魚類的雄性發育起到重要作用，Sox3則對魚類的雌性發育更重要。

1.3 DMRT基因家族

DMRT（Double-sex and Mab-3 related transcription factor）是近年新克隆到的一類編碼與性別決定相關的轉錄因子的基因家族，被認為是脊椎動物中最原始的性別決定基因，位于常染色體上，其功能可能與精巢足細胞的發育有關。迄今，已在魚類、爬行類、鳥類、哺乳類等脊椎動物中檢測到了DMRT基因，非脊椎動物如果蠅和線蟲中也發現了DMRT1基因參與性別決定，這充分顯示了該基因家族在進化上的高度保守性。作為發育基因，其作用機理是產生具有時空差異的轉錄調控因子，以鋅指方式與特異的DNA序列結合，在性別決定和分化發育中起調控作用。對半滑舌鰨[17]、尼羅羅非魚（Tilapia nilotica）[18]的研究發現DMRT1基因只在成魚的精巢中特異性地表達，在其他組織中無表達，這說明了DMRT1基因在雄性發育中起到重要作用。DMRT基因家族的其他成員在性別發育中也起到一定的作用。

DMY（the DM-domain gene on the Y chromosome）基因是在青鳉Y染色體上找到的一段DMRT1的復制片段，雌性個體中沒有它的同源序列，這是首次在魚類基因組中找到的，被證明是與精巢發生和分化直接相關的一個性別決定功能基因[2]。青鳉DMY基因是雄性個體正常發育的重要基因，Matsuda等[19]用一個攜帶DMY基因的117 kb DNA片段誘導硬骨魚類的性別分化，隨后發現了青鳉雌性（XX）個體向雄性方向發展。對于青鳉而言，雌雄個體的區別只是單個的基因，那么就可以利用雄性DMY基因的PCR擴增條帶的有無鑒定青鳉個體的雌雄性別。Kondo等[20]首先以與青鳉同屬的西里伯斯青鳉（Oryzias celebensis）為研究對象，以青鳉DMY和DMRT1基因為探針，用DNA印跡法研究在這種魚類中是否存在DMY基因，結果未能檢測出雄性特異性條帶。但是Matsuda等[21]通過PCR方法在弓背青鳉（Oryzias curvinotus）中克隆到了DMY基因。由于魚類在進化上原始而不徹底的特點，在性別決定上出現一定的偏差也是有可能的。

1.4 芳香化酶基因

芳香化酶是屬于細胞色素P450的一種復合酶，也是體內由雄激素合成雌激素的重要酶類。在魚類中，芳香化酶可通過調節體內雄激素和雌激素的比例，進而控制性別分化和發育的方向。硬骨魚類有腦型（cyp19a1b）和卵巢型（cyp19a1a）兩種芳香化酶基因，它們具有不同的表達調控機制，但具有相同的催化活性。芳香化酶的生物合成發生在所有脊椎動物中，但在大多數脊椎動物中只分布在腦和性腺中，在靈長類動物中的分布更廣泛，甚至在發育胎兒的胎盤及脂肪組織中也有分布[22]。Jeng等[23]對日本鰻鱺（Anguilla japonica）芳香化酶基因的研究發現，腦中芳香化酶的活性在雌雄個體中沒有差別，但在卵巢中能檢測到該基因，在精巢中卻無法檢測到，表明了芳香化酶對卵巢的分化起到重要作用。鄧思平[24]在對半滑舌鰨的研究中發現cyp19a1a只在性腺中表達，且在性腺發育過程中，精巢和卵巢中的芳香化酶基因的表達都逐漸增強，但卵巢中的表達量始終高于精巢，進一步用甲基睪酮浸浴處理和高溫誘導半滑舌鰨由雌性逆轉為雄性后，性腺中芳香化酶的表達量降低。這些結果表明cyp19a1a參與了半滑舌鰨的性腺發育和性別決定過程。青鳉芳香化酶基因有9個外顯子，其內含子大小明顯小于人類，但其剪接位點與人類的相同[25]，這些說明在脊椎動物中芳香化酶結構及其表達調節機制的保守性?，F已證明，給予芳香化酶抑制劑能誘導產生雄魚，這主要是因為阻止了芳香化酶基因的表達，導致雌激素含量減少所引起的。最近的研究發現環境因子對最終性別的影響可以通過調節芳香化酶的活性來實現。通過對芳香化酶作用及基因表達的研究顯示，芳香化酶基因是影響性腺分化較直接的因素，且芳香化酶基因與其他性別決定及分化相關基因間有抑制或促進作用，研究該基因表達的調控是魚類性別決定分子機制的重要部分。

1.5 FTZ-F1基因

FTZ-F1（Ftshi tarazu-factor1）是核受體超家族的一員，最初是在果蠅中發現的，對芳香化酶基因的表達起促進作用。Zhang等[26]用睪酮處理石斑魚的試驗證明了FTZ-F1受腦-垂體-性腺軸控制。Hofsten等[27]綜述了斑馬魚的性別相關基因，得出FTZ-F1在其性別決定與分化中起到關鍵性作用，其表達類型與生殖腺分化及功能相一致。此外，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[28]、黃鱔[29]、半滑舌鰨[30]等魚類中FTZ-F1在雌性個體中的表達量均高于雄性。

1.6 FOXL2基因

FOXL2（Winged helix/forkhead transcription factor gene 2）屬于轉錄因子家族，是目前發現的脊椎動物卵巢決定和分化的最早的標志性啟動基因，它可以調節卵巢芳香化酶，對卵巢的分化起到重要作用。Sridevi等[31]對革胡子鯰（Clarias gariepinus）的研究發現，FOXL2主要在卵巢和雌性個體的腦中，在產卵前其表達量最大，這說明其對卵巢的再生起到了重要作用。該研究證實了FOXL2對革胡子鯰芳香化酶的調控作用，并把FOXL2選定為一個對鯰雌性性腺發育很有潛力的卵巢和腦的標記。

1.7 Pod 1基因

過氧化物酶1（Peroxidase 1，Pod 1）是轉錄因子中堿性螺旋-環-螺旋家族的一個成員，已被證實與哺乳動物的性別分化和生殖腺發生相關。小鼠Pod 1基因的敲除，可導致個體發生由雄性到雌性的性逆轉[32]。在非哺乳類脊椎動物中的研究較少，Li等[33]從尼羅羅非魚中克隆并鑒定出Pod 1基因，通過原位雜交技術檢測出Pod 1的時空表達，在未分化的生殖腺中，Pod 1在雌雄兩性個體的體細胞中都有表達，隨后，在分化的稚魚和成魚的卵巢和精巢中持續表達，這說明Pod 1不是性別分化所必須的，但在雌雄兩性魚類生殖腺發育過程中起到重要作用。該研究第一次揭示了Pod 1在硬骨魚類性別分化初期和生殖腺發育中均起到了重要作用。

1.8 GSDF基因

GSDF（Gonadal soma-derived factor）基因是TGF-β超家族中奇異的一員，在硬骨魚類中很保守。Shibata等[34]從青鳉中克隆出GSDF基因，實時定量PCR技術顯示受精后6 d，雄性個體整個胚胎的GSDF基因的表達量升高，這與睪丸分化的起始是一致的。GSDF基因在XY型生殖腺中的表達量明顯高于XX型。XY型胚胎用17-β雌二醇處理后再進行實時定量PCR技術檢測，發現GSDF在處理后胚胎中的表達量下降。Gautier等[35]對斑馬魚的研究中發現GSDF是由單拷貝基因編碼的，其基因主要在成年個體的粒層細胞和支持細胞中表達。對GSDF及其鄰近基因的研究發現，GSDF是惟一在精巢中表達量高于卵巢的線性染色體基因，相反，GSDF相鄰基因，如nup54、aff1等則優先在雌性的生殖腺中表達。Sawatari等[36]報道GSDF刺激虹鱒的精原細胞的增殖和精子的發生，與其性別分化有一定的關系。

1.9 Fanconi anemia/BRCA基因

Fanconi anemia/BRCA（即范康尼貧血癥）是類似于骨髓衰竭、白血病、鱗狀細胞癌及包括生殖功能不良、不孕癥等發育異常的一種人類疾病。斑馬魚基因組與人類相似度達到87%，對于該基因只在斑馬魚中有研究。據Rodríguez-Marí等[37]的研究，斑馬魚有一個與人的FANC基因同源的基因，兩個及兩個以上FANG基因的突變[如fund和fancd1（brca2）]可導致其由雌性到雄性的性逆轉。Fancl是Fanconi anemia/BRCA DNA修復途徑中的一個成員，在減數分裂中對提高卵母細胞的成活率發揮了重要作用。該基因的突變可使卵原細胞高效轉化成成熟卵母細胞的過程受阻，而引起斑馬魚由雌性到雄性的性逆轉。

2 性別決定與分化相關基因之間的關系

2.1 Sox基因與DMRT基因在性別決定中的相互關系

在哺乳動物如小鼠中，SRY開始表達在DMRT1之后[38]，因此推斷，DMRT1位于SRY的上游，DMRT1啟動SRY的表達；在非哺乳類脊椎動物如雞的Sox9基因及爬行類、兩棲類、魚類中的DMRT1基因均在胚胎未分化的性腺中表達，因此推斷，在非哺乳類脊椎動物中，Sox9和DMRT1都可能位于性別決定基因的上游。

2.2 FTZ-F1基因與芳香化酶基因之間的關系

在包括人[39]及烏龜[40]在內的一些物種中已經證實了芳香化酶基因的表達量依賴于FTZ-F1的表達水平。在斑馬魚中，Cyp19的啟動子區域包含了FTZ-F1基因的結合位點，這說明FTZ-F1在性腺中對芳香化酶的表達起到一定的作用。

Watanabe等[41]對青鳉的研究發現，卵泡中芳香化酶基因的表達在轉錄水平上進行調節。他們從青鳉卵泡中克隆出編碼FTZ-F1樣蛋白的cDNA序列，在體外轉錄成mdFTZ-F1，與從青鳉卵泡中提取的核酸進行雜交，用核酸探針檢測出復合物，這說明在青鳉芳香化酶基因啟動子區域包含了孤核受體的結合基序。卵子發生時，mdFTZ-F1的轉錄正好與芳香化酶基因的轉錄相一致。轉染試驗進一步說明了mdFTZ-F1在青鳉芳香化酶基因啟動子區域潛在的轉錄調節活性。不同的是Liu等[42]對發生天然性逆轉且雄性先熟黑鯛（Acanthopagrus schlegeli）的兩種性別相關基因表達的研究中發現，卵巢中2+齡魚芳香化酶基因的轉錄水平明顯高于1+齡和5+齡魚，結果說明芳香化酶基因可能參與了黑鯛天然性逆轉，但卵巢中FTZ-F1在不同的年齡組中沒有變化，得出FTZ-F1對芳香化酶不起上調作用的結論。