金納米粒子表面能量轉移法測定水中的鉛離子

劉春等

摘要熒光素修飾的凝血酶適配體（5′FAMGGT TGG TGT GGT TGG3′）可與Pb2+選擇性地形成G四鏈體，這一構象變化能改變作為能量供體的熒光染料和作為能量受體的金納米粒子之間的距離，使體系的熒光強度與Pb2+濃度具有一定的相關性，從而建立了一種基于納米材料表面能量轉移靈敏檢測水溶液中Pb2+的分析方法。研究表明，在Pb2+濃度為12.5～100 nmol/L范圍內，熒光恢復效率（F/F0）與Pb2+濃度間呈良好的線性關系，線性回歸方程為y=0.910+0.007c（R2=0.997），檢出限為10 nmol/L。用本方法檢測自來水中Pb2+，結果令人滿意。

1引言

納米材料表面能量轉移（Nanomaterials surface energy transfer，NSET）在分析化學及生物藥物分析等領域被廣泛應用，如示蹤DNA或蛋白質分子的構象改變，識別DNA折疊的中間產物，監測DNA與金屬離子的相互作用以及測定與疾病相關的重要生物分子＼[1～4＼]。在本質上，NSET是偶極偶極相互作用，它與熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的不同之處在于NSET的能量受體是納米粒子表面，其通過在幾何學上各向同性的偶極向量分布接受供體的能量。NSET增大了供受體之間的能量轉移效率，相比FRET，它具有兩個重要特點＼[5，6＼]：同一個納米粒子能猝滅從可見到近紅外發射波長的熒光；能量轉移效率與距離的關系從1/R6變成1/R4，使得NSET的有效作用距離（約15 nm）比FRET（9 nm）增大了約2倍＼[6＼]。

鉛污染是一種分布廣泛的重金屬污染，它能導致人體腎臟損傷和智力發育遲滯＼[7＼]。因此，發展簡單靈敏的實時監測環境中Pb2+污染的方法意義重大。目前，基于脫氧核酶的鉛離子傳感器由于其高靈敏度和高選擇性被廣泛地用于測定水中Pb2+ ＼[8～14＼]。例如Lu等利用脫氧核酶建立了一系列比色法＼[10～12＼]和熒光共振能量轉移法＼[13＼]用于測定Pb2+。Pb2+脫氧核酶是由一個酶及底物鏈構成，當Pb2+存在時，脫氧核酶可以催化底物鏈發生特異性的水解斷裂。這一特性常被用來控制納米粒子聚集和熒光共振能量轉移供受體之間的距離。在這些方法中，靈敏度和選擇性都較好，但是由于所用脫氧核酶發生特異性水解斷裂的過程需要嚴格的反應條件，使得操作過程比較復雜。

研究發現，Pb2+由于具有與G四鏈體結構空腔尺寸適合的離子半徑（r =0.129 nm）以及與堿基的強配位作用，能與富含G堿基的寡聚核苷酸鏈形成穩定的G四鏈體結構＼[15＼]。近來有研究報道，凝血酶適配體（Thrombinbinding aptamer，TBA，5′GGT TGG TGT GGT TGG3′） 就可以選擇性地與Pb2+形成G四鏈體＼[16＼]。本研究中在TBA DNA的5′端修飾上熒光染料FAM作為能量供體，利用檸檬酸根穩定的球形金納米粒子作為能量受體，通過表面能量轉移建立了測定水溶液中Pb2+的分析方法。在Pb2+誘導下，該DNA鏈從自由纏繞狀態轉變成G四鏈體。由于單鏈DNA和G四鏈體的DNA（或雙鏈DNA）具有不同的靜電特性，對金納米粒子具有不同的吸附能力＼[17＼]。因此，與Pb2+濃度相關的DNA折疊過程會改變金納米粒子與染料分子之間的距離，從而影響兩者之間的能量轉移效率，具體體現在染料熒光強度的變化。本方法通過監測體系的熒光強度變化就可以簡單靈敏地實現對Pb2+的定量檢測。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Hitachi F2500型熒光分光光度計（日本日立公司），以485 nm激發，500～600 nm 之間掃描熒光發射光譜。Shimadzu UV3600 型紫外可見近紅外分光光度計（日本島津公司）；PHS3C 型酸度計（成都世紀方舟科技開發公司）； QL901型漩渦混合器（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）； 901型恒溫磁力攪拌器（上海精科實業有限公司）。

HAuCl4·4H2O（上海國藥集團化學試劑有限公司）；檸檬酸三鈉（上?；瘜W試劑公司）；Pb（NO3）2（重慶川東化工試劑公司）；熒光素修飾的單鏈DNA（5′FAMGGT TGG TGT GGT TGG3′，上海生工生物工程技術與服務有限公司合成）。將DNA干粉以5000 r/min離心5 min后，加入1 mL新煮沸并冷卻的超純水混勻，4 ℃下保存待用。實驗用水均為超純水（重慶利迪現代水技術設備有限公司LD50GE型超純水機制備，18.2 MΩ cm）。實驗中使用三羥甲基氨基甲烷乙酸（TrisHAc）緩沖溶液控制溶液酸度。試劑均為分析純。

2.2實驗方法

2.2.1金納米粒子（AuNPs）的合成根據文獻＼[18＼] 的方法稍作修改合成了檸檬酸根穩定的AuNPs。具體步驟為：在100 mL 平底燒瓶中依次加入49 mL 超純水，1 mL 1% HAuCl4，磁力攪拌下加熱至沸騰；劇烈攪拌下迅速加入1 mL 5% 檸檬酸三鈉，溶液的顏色變為淺黃色；繼續磁力攪拌并使溶液保持沸騰，5 min內可觀察到溶液的顏色從淺黃色經由藍黑色，最終轉變為鮮紅色；停止加熱，繼續攪拌直至溶液冷卻至室溫。測得該溶液的LSPR峰最大吸收波長在520 nm處。其濃度依照LSPR消光光譜和朗伯

3結果與討論

3.1NSET傳感法檢測鉛離子的原理

因而與AuNPs之間具有強烈的親和力，使得TBA很容易被吸附到金納米粒子表面＼[17＼]。通過TBA在金納米粒子表面的吸附，修飾于TBA上的FAM染料分子可以靠近金納米粒子，發生從FAM到金納米粒子表面的能量轉移，使得FAM染料的熒光被猝滅。當加入Pb2+后，TBA由于含有9個G堿基，它們能與Pb2+特異性結合，使TBA從自由纏繞結構轉變為G四鏈體。由于G四鏈體中暴露在外的是帶負電荷的磷酸鹽骨架，它們與帶負電荷的金納米粒子之間能產生強烈的靜電排斥力＼[17＼]，顯著增加了TBA上攜帶的染料分子與金納米粒子之間的距離，減弱了染料分子與金納米粒子之間的表面能量轉移，體系的熒光信號得到恢復。在一定范圍內，形成四鏈體的程度與Pb2+加入濃度成正比，使得體系的熒光強度也與Pb2+濃度成正比，據此建立了基于表面能量轉移的分析方法用于定量測定水中的Pb2+的方法。

為了示蹤Pb2+引起的TBA構象改變以及與AuNPs之間的表面能量轉移，利用普通的熒光分光光度計分別測定Pb2+存在與否情況下修飾于TBA鏈上的FAM的熒光強度（圖2）。從圖2可見，在沒有AuNPs和Pb2+存在情況下，FAMTBA在520 nm處展示出很強的熒光發射（圖2a）；當加入AuNPs后，由于AuNPs與FAM之間有效的表面能量轉移，FAMTBA的熒光幾乎被完全猝滅（圖2c）。這一現象與文獻＼[21＼]所觀察到的金納米粒子對熒光團有較高猝滅效率是一致的。而當Pb2+和AuNPs均被加入體系中時，由于Pb2+誘導FAMTBA的構象發生改變，使得FAM與AuNPs的距離大大增加，降低了表面能量轉移的效率，從而使熒光得到一定程度的恢復（圖2b），據此實現對Pb2+的檢測。

3.2其它金屬離子的響應3.3線性范圍及實際應用

在最優實驗條件下，利用TBA探針基于表面能量轉移選擇性測定Pb2+。在Pb2+濃度為12.5～100 nmol/L范圍內，獲得了熒光恢復效率（F/F0）與Pb2+濃度間的線性關系，線性回歸方程為y=0.910+0.007c （y為體系的熒光恢復效率F/F0，c為Pb2+濃度（nmol/L）， R2=0.997，圖4），檢出限（3σ）為10 nmol/L。 依據美國環境保護署（EPA）規定的飲用水中Pb2+濃度不得高于0.015 mg/L （折合72 nmol/L）的標準＼[13＼]，本方法對Pb2+的線性響應范圍正好可用于監測飲用水中Pb2+的含量。采用標準樣品加入法，對自來水中Pb2+進行定量檢測。為避免次氯酸鹽的強氧化性對實驗的干擾，在分析之前，自來水需先煮沸。實驗結果見表1，標準加入回收率結果令人滿意。

4結論

通過Pb2+誘導FAMTBA形成G四鏈體，并基于FAM與AuNPs之間的表面能量轉移，建立了一種簡單、快速、靈敏的Pb2+傳感方法。在最佳實驗條件下，其檢測線性范圍為12.5～100 nmol/L，檢出限（3σ）為10 nmol/L。美國環境保護署（EPA）規定飲用水中Pb2+濃度不得高于0.015 mg/L （折合72 nmol/L），故本方法可用于監測自來水中的Pb2+。

4LIU Chun， WU Tong， HUANG ChengZhi. Sci. China Ser. B， 2010， 40（5）： 531-537

劉 春， 吳 同， 黃承志. 中國科學B： 化學， 2010， 40（5）： 531-537

5Griffin J， Singh A K， Senapati D， Rhodes P， Mitchell K， Robinson B， Yu E， Ray P C. Chem. Eur. J.， 2009， 15（2）： 342-351

6Jennings T L， Singh M P， Strouse G F. J. Am. Chem. Soc.， 2006， 128（16）： 5462-5467

7Bridgewater B M， Parkin G. J. Am. Chem. Soc.， 2000， 122（29）： 7140-7141

8Wei H， Li B， Li J， Dong S， Wang E. Nanotechnology， 2008， 19： 095501

9GAO XiaoXia， JIA YuHua， YANG JinFeng， LI JiShan， YANG RongHua. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（5）： 670-674

高曉霞， 賈玉華， 楊金鳳， 李繼山， 楊榮華. 分析化學， 2013， 41 （5）： 670-674

10Liu J， Lu Y. J. Am. Chem. Soc， 2003， 125（22）： 6642-6643

11Mazumdar D， Liu J， Lu G， Zhou J， Lu Y. Chem. Commun.， 2010， 46（9）： 1416-1418

12Wang Z， Lee J H， Lu Y. Adv. Mater.， 2008， 20： 3263-3267

13Lan T， Furuya K， Lu Y. Chem. Commun.， 2010， 46（22）： 3896-3898

14ZHAO YongXi， QI Lin， YANG WeiJun， WEI Shuai， WANG YaLing. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（8）： 1236-1240

趙永席， 齊 林， 楊衛軍， 魏 帥， 王亞玲. 分析化學， 2012， 40（8）： 1236-1240

15Kotch F W， Fettinger J C， Davis J T. Org. Lett.， 2000， 2（21）： 3277-3280

16Liu C W， Huang C C， Chang H T. Anal. Chem.， 2009， 81： 2383-2387

17Li H， Rothberg L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2004， 101（39）： 14036-14039

18Chen S J， Chang H T. Anal. Chem.， 2004， 76（13）： 3727-3734

19Huang C C， Huang Y F， Cao Z， Tan W， Chang H T. Anal. Chem.， 2005， 77： 5735-5741

20Li T， Wang E， Dong S. Anal. Chem.， 2010， 82（4）： 1515-1520

21Jennings T L， Schlatterer J C， Singh M P， Greenbaum N L， Strouse G F. Nano Lett.， 2006， 6（7）： 1318-1324

22Nagatoishi S， Nojima T， Galezowska E， Juskowiak B， Takenaka S. ChemBioChem.， 2006， 7： 1730-1737

23Nagatoishi S， Nojima T， Juskowiak B， Takenaka S. Angew. Chem. Int. Ed.， 2005， 44： 5067-5070

AbstractWe established a sensitive method for the detection of lead ions in aqueous solution based on the surface energy transfer between gold nanoparticles and fluorescent dyes. The fluoresceinmodified thrombin aptamer （5′FAMGGT TGG TGT GGT TGG3′） can be selectively transformed to Gquadruplex induced by lead ions. The conformation changes of the aptamer can alter the distance between the energy donor of fluorescent dyes and the energy receptor of gold nanoparticles， and further enhance the fluorescence intensity. The fluorescence recovery efficiency （F/F0） is proportional to the concentration of lead ions in the range of 12.5-100 nmol/L following the linear regression equation of y=0.910+0.007c（R2=0.997）and the limit of determination is about 10 nmol/L. The proposed method has been applied to the determination of lead ions in tap water with satisfied results.

KeywordsAptamer； Gquadruplex； Gold nanoparticles； Surface energy transfer； Lead ions

20Li T， Wang E， Dong S. Anal. Chem.， 2010， 82（4）： 1515-1520

21Jennings T L， Schlatterer J C， Singh M P， Greenbaum N L， Strouse G F. Nano Lett.， 2006， 6（7）： 1318-1324

22Nagatoishi S， Nojima T， Galezowska E， Juskowiak B， Takenaka S. ChemBioChem.， 2006， 7： 1730-1737

23Nagatoishi S， Nojima T， Juskowiak B， Takenaka S. Angew. Chem. Int. Ed.， 2005， 44： 5067-5070

AbstractWe established a sensitive method for the detection of lead ions in aqueous solution based on the surface energy transfer between gold nanoparticles and fluorescent dyes. The fluoresceinmodified thrombin aptamer （5′FAMGGT TGG TGT GGT TGG3′） can be selectively transformed to Gquadruplex induced by lead ions. The conformation changes of the aptamer can alter the distance between the energy donor of fluorescent dyes and the energy receptor of gold nanoparticles， and further enhance the fluorescence intensity. The fluorescence recovery efficiency （F/F0） is proportional to the concentration of lead ions in the range of 12.5-100 nmol/L following the linear regression equation of y=0.910+0.007c（R2=0.997）and the limit of determination is about 10 nmol/L. The proposed method has been applied to the determination of lead ions in tap water with satisfied results.

KeywordsAptamer； Gquadruplex； Gold nanoparticles； Surface energy transfer； Lead ions

20Li T， Wang E， Dong S. Anal. Chem.， 2010， 82（4）： 1515-1520

21Jennings T L， Schlatterer J C， Singh M P， Greenbaum N L， Strouse G F. Nano Lett.， 2006， 6（7）： 1318-1324

22Nagatoishi S， Nojima T， Galezowska E， Juskowiak B， Takenaka S. ChemBioChem.， 2006， 7： 1730-1737

23Nagatoishi S， Nojima T， Juskowiak B， Takenaka S. Angew. Chem. Int. Ed.， 2005， 44： 5067-5070

AbstractWe established a sensitive method for the detection of lead ions in aqueous solution based on the surface energy transfer between gold nanoparticles and fluorescent dyes. The fluoresceinmodified thrombin aptamer （5′FAMGGT TGG TGT GGT TGG3′） can be selectively transformed to Gquadruplex induced by lead ions. The conformation changes of the aptamer can alter the distance between the energy donor of fluorescent dyes and the energy receptor of gold nanoparticles， and further enhance the fluorescence intensity. The fluorescence recovery efficiency （F/F0） is proportional to the concentration of lead ions in the range of 12.5-100 nmol/L following the linear regression equation of y=0.910+0.007c（R2=0.997）and the limit of determination is about 10 nmol/L. The proposed method has been applied to the determination of lead ions in tap water with satisfied results.

KeywordsAptamer； Gquadruplex； Gold nanoparticles； Surface energy transfer； Lead ions