慢性乙型肝炎患者MDSC的含量測定及其免疫抑制作用

韓素麗

慢性乙型肝炎患者MDSC的含量測定及其免疫抑制作用

韓素麗

目的 探討并分析正常人對照組及慢性乙型肝炎患者外周血中MDSCs含量與病毒載體、疾病預后的關系。方法 分別用流式細胞儀檢測健康人和慢性乙型肝炎患者外周血MDSCs含量,并進行病毒載量和疾病預后資料的相關分析。結果 慢性乙型肝炎組的MDSCs百分含量相與正常對照組相比, 顯著增多(P<0.05)；而且通過病例資料分析發現MDSCs含量不僅隨著慢性HBV病重程度逐級升高,而且與慢性乙肝疾病預后HBV-DNA含量密切相關。結論 MDSCs可作為慢性乙型肝炎的一種新型血清標志物, 用于患者的診斷和預后指標。

HBV；MDSCs；流式細胞術

乙型病毒(Hepatitis B virus, HBV)是一種嗜肝DNA病毒,常引起患者急性肝炎和慢性肝炎的發生, 除可發生肝細胞壞死、纖維化和硬化外, 嚴重者還可引起肝細胞癌的發生。而且大部分乙型肝炎患者主要為慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B)。而我國又位于肝病大國之首, 因此, 如何預防和治療乙肝病毒感染和慢性乙肝患者疾病的惡化顯得尤為重要。

近年有研究表明, 慢性乙型肝炎患者難以治愈主要與患者外周血、肝臟組織中存在的骨髓系來源抑制細胞(myeloidderived suppressor cells, MDSCs)有關, 該細胞群不但種類繁多,而且具有強大的、廣泛的免疫抑制作用, 并且還能誘導Treg的產生, 因此, 研究攻克MDSCs產生的免疫抑制作用意義重大, 它是解決慢性乙肝治療的一大難題。而關于MDSCs與慢性乙型肝炎中的研究尚不多見,因此, 本課題擬對慢性乙型肝炎的患者外周血中MDSC細胞數量與HBV病毒載量進行研究, 并探討MDSCs與疾病轉歸和預后的關系, 為慢性乙型肝炎的治療或監測用藥提供另外新的思路和線索。

1 材料與方法

1. 1 材料

研究對象：實驗組為本院確診的慢性乙型肝炎患者中,根據生化指標分別篩選輕度慢性乙型肝炎組、中度慢性乙型肝炎組和重度慢性乙型肝炎組三組各150例；其中, 平均年齡(38±7)歲；對照組為健康者為200例, 平均年齡(45±5)歲。

試劑：CD34、CD33、CD15流式抗體, ALT、AST和TBI ELISA試劑盒、細胞裂解液等。

儀器：流式細胞儀、全自動生化分析儀、PCR擴增儀、超速離心機等。

1. 2 方法

1. 2. 1 流式細胞術檢測各組外周血中MDSCs細胞含量 ①將3~5 ml慢性乙型肝炎患者和健康者的靜脈血分別置于含有肝素鈉的真空采血管中, 室溫放置一段時間, 于 4 h 內處理所采集的標本。②將紅細胞裂解液恢復至室溫后, 加入個采集管中。③ 根據樣品編號對流式管進行編號, 然后按順序擺放于試管架上, 每管加入 100 μl 全血。④向各管中加入一定量的相應流式抗體, 震蕩混勻后, 于4℃避光孵育 30 min。⑤每管加入紅細胞裂解液 3~4 ml, 置冰上裂解 10 min 后, 1200 rpm 離心 10 min, 棄上清。⑥如果紅細胞未完全裂解, 則加入1~2 ml 紅細胞裂解液于冰上繼續裂解 5 min, 直至紅細胞完全裂解。然后在1200 rpm 離心 10 min, 棄上清。⑦加入流式洗液3~5 ml, 混勻, 并于1500 rpm離心10 min。⑧重復上一步操作。⑨最后每管加入 200~300 μl 流式細胞洗液將細胞沉淀充分懸浮, 然后通過流式細胞儀上機檢測。

1. 2. 2 全自動生化分析儀測定ALT、AST和TBI 各組分別抽取肝素抗凝血3~4 ml, 3500 rpm 離心 5 min, 上機測定血漿中的ALT、AST和TBI。

1. 2. 3 PCR方法檢測各組乙肝病毒載量 各組分別抽取非抗凝血3~4 ml, 分離血清, 擴增儀分析病毒載量。

表1 各組外周血MDCSs含量百分比

1. 2. 4 ELISA法檢測血清NOS水平 按試劑盒的使用說明進行操作。

1. 2. 5 統計學方法 所有數據將采用SPSS17.0統計軟件進行處理, 數值以均數±標準差( x-±s)表示。統計方法均采用單因素方差分析, 相關分析采用Pearosn分析, 而且以P<0.05認定為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 健康對照組、慢性乙型肝炎輕度組、慢性乙型肝炎中度組、慢性乙型肝炎重度組外周血中MDSCs細胞含量 通過流式細胞儀對各組進行MDSCs百分含量的檢測, 各組含量如下表1, MDSCs在乙肝患者外周血中相對對照組均顯示高表達(P<0.05),而且MDSCs的含量隨著慢性乙肝攜帶者病情的增加的增大。

2. 2 各實驗組患者中血漿的MDSCs含量及HBV-DNA含量間的相關分析 通過分析MDSCs含量和患者HBV-DNA含量的關系, 發現MDSCs與HBV-DNA含量呈正相關(r=0.86, P<0.05), 即隨著HBV含量的增大, 外周血中出現的MDSCs的含量百分比增大。

3 討論

近年研究證實, 免疫耐受、高HBV-DNA血癥以及乙型肝炎病毒的變異是導致慢性乙型肝炎的抗病毒治療失敗的主要原因, 其中, 免疫耐受是重中之重［1］。而且根據最近研究報道, 骨髓產生的髓系來源抑制細胞(myeloid-derived suppoessor cells,MDSCs)是機體產生免疫耐受的主要來源, 它能通過產生不同的免疫抑制細胞如Treg細胞、TAM腫瘤巨噬細胞、NSC自然抑制性細胞等, 抑制宿主免疫激活、進而促進感染性疾病的進程, 導致各種免疫炎癥疾病和腫瘤的發生［2］。因此本課題通過對MDSCs在慢性乙型肝炎中的作用進行研究, 即通過對正常對照組、不同程度慢性乙肝患者的外周血進行MDSCs細胞含量的流式檢測分析, 結果發現, 外周血中慢性乙型肝炎患者的MDSCs細胞含量與正常對照組的相比, 顯著升高, 說明外周血中MDSCs細胞含量的增加可能是導致HBV-DNA大量復制、慢性乙肝疾病惡化的因素之一［3］。不僅如此, 通過進行MDSCs含量與HBV-DNA含量相關分析, 還發現, 兩者呈正相關, 說明兩者可能具有相互促進作用, 提示MDSCs的產生是促進HBV-DNA復制的結果［4］, 提示, MDSCs可作為HBV患者的一種診治指標, 應用于臨床。

外周血MDSCs與HBV-DNA復制和疾病病程密切相關,可作為慢性乙型肝炎的一種診斷指標或檢測, 有望應用于臨床。

［1］ 李婕.慢性乙型肝炎患者HBV抗原特異性Th17細胞亞群的功能及其免疫調控機制的臨床研究.浙江大學, 2011.

［2］ 江匯涓,邵宗鴻.MDSCs的功能研究進展與應用前景.臨床血液學雜志, 2013,26(5):348-351.

［3］ 馬萍.替比夫定治療對HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者免疫功能的影響.天津醫科大學, 2012.

［4］ Osruand-RosenbergS,Sinha P.Myeloid-derived supperssor cells:linking inflammation and cacer. Cancer Immunol, 2009, 182(8): 4499-4506.

Content determination of MDSC for chrionic hepatitis B patients and its effect on the immune suppression

HAN Su-li. Shanxi Medical University
(Peace Hospital Affiliated to Changzhi Medical college), Taiyuan 030001, China

Objective To investigate the relationship between the analysis and the normal control group and chronic hepatitis B in the peripheral blood of patients with viral vectors, MDSCs content and the prognosis of the disease. Methods Patients with healthy people were detected by flow cytometry and chronic hepatitis B, peripheral blood MDSCs content, correlation analysis and viral load and disease outcome data. Results the percentage of MDSCs phase and the chronic hepatitis B group compared with the normal control group, increased significantly (P<0.05); and through the case analysis found that MDSCs was not only with chronic HBV severity gradually increased, and closely related to chronic hepatitis B disease prognosis HBV-DNA content. Conclusion MDSCs can be used as a new type of chronic hepatitis B serum marker for diagnosis and prognosis, patients.

HBV; MDSCs; Flow cytometry

030001 山西醫科大學/山西省長治市長治醫學院附屬和平醫院檢驗科

趙素蓮