雞嗉囊中淋巴細胞發育的研究

李 磊，張英楠，楊樹寶，馮小剛，劉 瑩，董紅艷，馬金萍，欒維民，4

(1吉林農業大學動物科學技術學院，吉林長春 130118; 2吉林農業大學發展學院，吉林長春 130600;3吉林農業大學生命科學學院，吉林長春 130118; 4吉林農業大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，吉林長春 130118)

雞嗉囊中淋巴細胞發育的研究

李 磊1，張英楠2，3，楊樹寶1，馮小剛1，劉 瑩1，董紅艷1，馬金萍1，欒維民1，4

(1吉林農業大學動物科學技術學院，吉林長春 130118; 2吉林農業大學發展學院，吉林長春 130600;3吉林農業大學生命科學學院，吉林長春 130118; 4吉林農業大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，吉林長春 130118)

【目的】研究雞出殼后不同日齡嗉囊中T淋巴細胞及其亞群和B淋巴細胞的定位分布及數量變化規律等一系列的發育過程.【方法】采用單克隆抗體，通過免疫組織化學方法，觀察并統計各取材日齡相應細胞的分布和數量.【結果和結論】1日齡時，CD3+、CD4+和CD8+細胞即已出現，Bu-1b+細胞于出殼后4日齡時出現.定位分布上，CD3+細胞主要分布于黏膜上皮基底層及固有層中，7日齡首次出現以CD3+細胞為中心的淋巴聚集物;CD4+細胞主要分布于固有層中;CD8+細胞最初主要分布在黏膜固有層中，隨日齡增長逐漸向上皮方向突入，最終形成含有CD8+細胞浸潤的淋巴上皮;Bu-1b+細胞主要分布于黏膜固有層中，特別是在小血管周圍.于35日齡觀察到以Bu-1b+細胞為中心的生發中心.在數量變化上，CD3+、CD4+、CD8+細胞數量整體呈逐漸增加趨勢，部分陽性細胞數量在14和21日齡時稍有下降，35～56日齡時陽性細胞數量緩慢增加，基本達到成熟水平.Bu-1b+細胞數量隨著日齡的增加持續增多，且后期的增長速率大于T細胞的增長速率.結果表明，嗉囊作為雞消化系統的一部分，具有由淋巴細胞和淋巴聚集物構成的免疫防線，為腸相關淋巴組織中的一個重要組成部分.

嗉囊;發育;定位分布;腸相關淋巴組織

隨著雞黏膜免疫研究的深入，雞黏膜免疫組織學內容亦趨完善.大量研究表明，禽類腸相關淋巴組織由腸道中集合的淋巴組織和散在的淋巴細胞一起構成.前者包括食管扁桃體、幽門扁桃體、盲腸扁桃體等，后者則為分布在各腸段中的散在的淋巴細胞，其主要分布于消化道、前胃、回腸和直腸等組織中［1-3］.嗉囊作為食物的最初儲存場所，能使禽類攝取的食物保持適當的溫度和濕度，并對其進行浸潤與軟化，利于胃腸道對食物進一步消化吸收.試驗表明，切除嗉囊后雞消化能力明顯下降，并且更容易出現細菌感染等疾病，提示嗉囊對于食物中的微生物具有初步的抵御作用［4-5］.

馮小剛等［6］于2013年通過免疫組織學方法發現雞嗉囊中亦有大量的淋巴細胞分布，并將其歸為腸相關淋巴組織中的重要組成部分.鑒于此，本試驗對雞嗉囊的淋巴細胞做進一步研究.旨在觀察雞嗉囊中淋巴細胞的定位分布及數量變化情況，探索嗉囊免疫基礎的建立過程，從而為腸相關淋巴組織的完善增添新的內容，同時也為疫苗的研發和嗉囊疾病的治療提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

將100枚清潔級海藍白種蛋進行孵化，雞出殼后置于動物室中常規飼養.分別在出殼后1、4、7、14、21、27、35及56日取材.每次取7只雞新鮮嗉囊的相同部位，置于蛋白包埋液(OCT)中包埋后進行低溫切片，片厚5 μm.-80℃超低溫冰箱保存備用.

1.2 抗體

試驗所用單克隆抗體見表1.

表1 試驗使用的單克隆抗體Tab.1 Monoclonal antibodies used in this experiment

1.3 試劑和儀器

日本櫻花蛋白包埋劑(OCT)，AAF液，丙酮，伊紅和3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(APES)等.Leica CM1850冰凍切片機，UltraSensitiveTM SP超敏試劑盒kit-9710(福州邁新公司)，Olympus CX41顯微鏡，Image-pro Plus 5.1圖像分析軟件(美國 Media Cybernetics公司)，Pixera pro150ES圖像采集器.

1.4 試驗方法

取嗉囊切片做以下處理：滴加過氧化物酶阻斷溶液(試劑A)，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性;PBS洗3次，各3 min;滴加正常非免疫動物血清(試劑B)封閉，室溫下孵育10 min;滴加相應稀釋單抗工作液50 μL，4℃條件過夜;PBS洗3次，各3 min;滴加生物素標記的第二抗體(試劑C)，室溫孵育10 min;PBS洗3次，各3 min;滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10 min;PBS洗3次，各3 min;DAB顯色;蘇木精復染;脫水;透明;鏡檢封片、照相.

1.5 圖像分析及統計學處理

對各抗體陽性細胞進行分析，并選擇放大倍數為100的圖片，采用Image-pro Plus 5.1圖像分析軟件對單位視野內的免疫組織化學陽性細胞的面積進行測定.對每個抗體對應的各個部位的切片隨機選定5個視野，然后求平均值.采用SPSS19.0單因素方差分析進行統計分析.

2 結果與分析

2.1 CD3+細胞的發育規律

出殼后1日齡時，可見少量CD3+細胞分布于嗉囊黏膜固有層的小血管周圍(圖1a);4日齡時，CD3+細胞數量增多，散布于黏膜固有層與黏膜下層;7日齡時，首次觀察到以T細胞為中心的淋巴聚集物(圖1b)，且有部分CD3+細胞分布于沿黏膜上皮下區域;27日齡時，部分CD3+細胞出現在腺體周圍，并向腺體上皮突入;35日齡時，CD3+細胞出現在黏膜上皮中，形成嵌有淋巴細胞的黏膜上皮，同時，腺體與上皮間固有層中出現彌散的淋巴聚集物(圖1c).56日齡時，血管周圍陽性細胞較少，但淋巴聚集物增多，黏液腺上皮受淋巴細胞浸潤明顯，且部分腺體上皮和黏膜上皮轉化為淋巴上皮(圖1d).

CD3+細胞于1日齡時即出現，隨后于4日齡明顯增多(P＜0.05)，其后逐漸增多，并于21日齡時再次明顯增多(P＜0.05)，隨后CD3+細胞增加緩慢，呈較穩定水平(圖2).

2.2 CD4+細胞的發育規律

1日齡時，少量的CD4+細胞出現在嗉囊固有層的血管周圍(圖1e);4日齡時，固有層中的CD4+細胞數量明顯增多;7日齡時，觀察到CD4+細胞出現在食管腺周圍，并有向腺體內部突入趨勢(同CD3+細胞一樣，首次觀察到含CD4+細胞的淋巴聚集物); 21日齡時，CD4+細胞于濾泡間區域聚集，并發生明顯浸潤至腺體的現象;35日齡時，分布于聚集物的CD4+細胞，一部分位于濾泡外區域，而另一部分依然位于聚集物中心(圖1f、1g);56日齡時，部分CD4+細胞圍繞在腺體周圍，使部分腺體上皮轉化為淋巴上皮(圖1h).

CD4+細胞于1日齡能夠被觀察到，4日齡時增加明顯(P＜0.05)，隨后小幅上升，并于21日齡時再次顯著升高(P＜0.05)，之后數量逐漸趨于穩定水平(圖2).

2.3 CD8+細胞的發育規律

1日齡時，單個CD8+細胞出現在嗉囊黏膜固有層和肌層中，偶在上皮基底層見單個陽性細胞分布; 4日齡時，多數散在的CD8+細胞圍繞在固有層的小血管周圍(圖1i)，上皮基底層可見單個陽性細胞浸潤;14日齡時，CD8+細胞逐漸向上皮內遷移(圖1j);27日齡時，固有層中的陽性細胞多聚集在血管周圍、腺體與上皮間區域;35日齡時，浸潤上皮基底層的陽性細胞增多(圖1k);56日齡時，部分黏膜上皮和腺體上皮被CD8+細胞浸潤，使其轉化為淋巴上皮.在彌散淋巴組織中也有豐富的CD8+細胞聚集，而固有層中的陽性細胞分布漸少(圖1l).

CD8+細胞數量在4、14日齡時顯著增加(P＜0.05);而在21日齡時有所減少，但不顯著(P＞0.05);27日齡時，CD8+細胞數量顯著增加(P＜0.05);35至56日齡，CD8+細胞數量逐步增加，但變化不顯著(P＞0.05)(圖2).

2.4 Bu-1b+細胞的發育規律

4日齡時，極少數的Bu-1b+細胞出現在嗉囊黏膜固有層中;7日齡時，在固有層小血管周圍、腺體與上皮間固有層中發現少數的Bu-1b+細胞(圖1m)，此時Bu-1b+細胞在其他部位分布仍極少;14日齡時，Bu-1b+細胞的分布較之前日齡分布更廣，散在分布于固有層中;27日齡時，Bu-1b+細胞初步形成聚集區，但上皮并未出現陽性細胞浸潤;35日齡時，出現了以Bu-1b+細胞為中心的淋巴聚集物和大量散在的陽性淋巴細胞，上皮也出現少量Bu-1b+細胞浸潤(圖1n);56日齡時，Bu-1b+細胞以散在的和聚集的形式大量分布于上皮下的固有層中，但上皮浸潤依舊僅發生在聚集物和腺體上方的上皮基底層中(圖1o).

4～21日齡，Bu-1b+細胞的數量呈增長趨勢，但并不顯著(P＞0.05);27日齡時，Bu-1b+細胞數量急速增長(P＜0.05);35日齡時，Bu-1b+細胞的數量也顯著增加(P＜0.05);與35日齡相比，56日齡時，Bu-1b+細胞的數量有所上升，但不顯著(P＞0.05)(圖2).

圖1 不同日齡時雞嗉囊中T淋巴細胞亞群和B淋巴細胞的分布情況Fig.1 The distribution of T lymphocyte subpopulations and B lymphocytes in crop of different day-old chickens

圖2 雞嗉囊中T淋巴細胞及其亞群、B淋巴細胞的發育變化Fig.2 Ontogenetic changes of T lymphocyte subsets and B lymphocytes in the chicken crop

3 討論與結論

腸相關淋巴組織同呼吸道相關淋巴組織、生殖道相關淋巴組織一起構成了禽類體內共同黏膜免疫的防御系統.根據Castelyn等［7］報道，雞腸相關淋巴組織由食管扁桃體、幽門扁桃體、回腸派氏結及盲腸扁桃體等腸道集合淋巴組織以及散在于食管、腺胃、十二指腸、回腸及泄殖腔等組織中的淋巴細胞共同組成.然而，嗉囊作為雞食管的一個重要組成部分，時刻受到夾雜于食物中大量的物理性、生物病原體的侵擾.馮小剛等［6］發現雞嗉囊中亦有大量淋巴細胞分布，并將其劃歸為腸相關淋巴組織中的一個不可缺少的部分.基于此，本研究結合禽類免疫學與發育學，通過免疫組織化學方法觀察雞嗉囊免疫活性細胞發育的日齡相關性變化，闡述B淋巴細胞、T淋巴細胞及其亞群的分布，遷移定位和數量變化情況.

本研究發現，1日齡時，CD3+、CD4+和CD8+細胞即已出現，Bu-1b+淋巴細胞于出殼后4日齡時出現.定位分布上，CD3+細胞主要分布于黏膜上皮基底層及固有層中，以CD3+細胞為中心的淋巴聚集物首次出現在7日齡;CD4+細胞主要分布于固有層中;CD8+細胞最初主要分布在黏膜固有層中，隨日齡增長逐漸向上皮方向突入，最終形成淋巴上皮; Bu-1b+細胞主要分布于黏膜固有層中，特別是在小血管周圍.35日齡時，觀察到以Bu-1b+細胞為中心的生發中心.并且CD3+、CD4+細胞數量于4日齡開始顯著持續增加，這與Friedman等［8］報道的法氏囊與胸腺T淋巴細胞在4日齡時發生第2次遷移至腸道的結果相一致，表明此時T淋巴細胞已經發育成熟.而在14日齡(CD3+和CD4+細胞)和21日齡(CD8+細胞)時陽性細胞數量略有下降，這與欒維民等［9-10］及楊樹寶等［11］對食管扁桃體、盲腸扁桃體等發育研究結果基本一致.此外本研究還發現，在嗉囊中存在由淋巴細胞浸潤而轉化成的淋巴上皮，主要包括部分黏膜淋巴上皮和腺上皮，分析其可能與嗉囊特有的腔狀結構有關.嗉囊為雞飽腹后的儲食場所，時刻受到來自食物中的大量病原體的侵擾，所以要求其在潤濕食物的基礎上同時能夠抵御食源性抗原的不利影響.由CD3+、CD8+細胞浸潤轉化而成的黏膜淋巴上皮能夠抵御來自腔內的部分細菌及病原體的侵擾，逃過此屏障進一步浸入黏膜的微生物則會遭遇腺上皮轉化而來的淋巴上皮的再次抵制，誘發局部黏膜免疫.

本試驗中雖未見大量淋巴生發中心的出現，但的確有較多的淋巴聚集物存在，同時Bu-1b+細胞的數量隨著日齡增長呈上升趨勢，這與之前的報道有所差異［12］.試驗證明，生發中心的出現與病原體侵染相關，表現為黏膜受到外界刺激時，黏膜內B淋巴細胞受到刺激后，局部代謝增強，細胞快速增殖，形成生發中心，進而引起免疫應答.本研究中，可能由于飼養環境單一，試驗雞未接觸大量流行病原體，故不能引起大量的生發中心產生.同時，也可能與消化道免疫的基礎有關.有研究報道，雞消化道中免疫系統早期以T淋巴細胞免疫反應為主，其細胞數量增長趨勢遠大于B淋巴細胞.而到6周齡后，B淋巴細胞的數量顯著增加并大于T淋巴細胞數量，表現為以B淋巴細胞免疫為主，這亦可能是早期未見大量生發中心，而Bu-1b+細胞卻一直增加的原因［12-14］.有趣的是，本試驗在雞出殼后7～56日齡間均能觀察到以T淋巴細胞為中心，而B淋巴細胞圍繞在周圍的獨特淋巴聚集物.通過對比前人的研究結果，在腸道中僅有腺胃和法氏囊中出現了此種情況［15-16］，而本試驗的研究對象嗉囊，同前胃一樣為消化道中僅有的擁有較大直徑的空腔狀器官，這可能是出現共同結果的一個原因，但具體分布原因尚需進一步深入研究.

本試驗結果表明，嗉囊不僅是雞儲存食物的第一場所，亦具有腸黏膜免疫的基礎——即由淋巴細胞和淋巴聚集物構成的免疫防線.同時，嗉囊淋巴細胞的遷移規律和分布情況，同其他腸組織淋巴細胞遷移和定位情況相一致，進一步驗證了嗉囊可能是腸相關淋巴組織中的一個重要組成部分.同時，本試驗描述了嗉囊淋巴細胞的發育情況，分析了嗉囊免疫系統的建立和發生，為治療嗉囊病以及雞疫苗的研發，進行實時性免疫提供理論依據.

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【責任編輯 柴 焰】

A study on development of lymphocytes in the chicken crop

LI Lei1，ZHANG Yingnan2，3，YANG Shubao1，FENG Xiaogang1，LIU Ying1，DONG Hongyan1，MA Jinping1，LUAN Weimin1，4
(1 College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China; 2 College of Development，Jilin Agricultural University，Changchun 130600，China; 3 College of Life Science，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China; 4 Key Laboratory of Animal Production＆Product Quality and Security，Ministry of Education，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China)

【Objective】To study the appearance，distribution and quantity variation of immunocytes—T lymphocytes and its subpopulations and B lymphocytes in different periods，analyzing the developmental process of immunocytes in the chicken crop.【Method】The mono-antibodies and immunohistochemistry was used to observe the distribution and count the number of the relevant cell in every age.【Result and conclusion】The results showed that CD3+，CD4+and CD8+cells appeared in the first day after post-hatching.Bu-1b+cells were observed in the 4rh day.CD3+cells mainly distributed in the epithelium and lamina propria，and the lymphoid aggregates covered by CD3+cells were first observed in the 7th day after post-hatching.CD4+cells were located in the lamina propria.At first，CD8+cells mainly distributed in the lamina propria of the mucosa.With the age increasing，CD8+cells slightly migrated and infiltrated to the epithelium of the mucosa，which were transformed to the lymphoepithelium.Bu-1b+cells mainly distributed in the lamina propria，especially around the vessels.The germinal center which was covered by the Bu-1a+cells was first observed in the 35th day after post-hatching.The amount of CD3+，CD4+，and CD8+cells kept increasing with the age;the amount of parts of positive cells decreased in the 14th and 21th day;it slightly increased after this date and reached mature level around the 56th day.Bu-1b+cells continuously kept increasing with age，its rising rate was higher than T lymphocytes during the later period.The research showed that as a part of the digest system in the chicken，the crop posses ses the mucosal immunity which consists of the lymphoid aggregates and the lymphocytes.The crop is an important part of gut-associated lymphoid tissue(GALT).

crop;development;location and distribution;gut-associated lymphoid tissue(GALT)

S852.1

A

1001-411X(2014)03-0024-06

2013-09-11 優先出版時間：2014-03-31

優先出版網址：http:∥www.cnki.net/kcms/doi/10.7671/j.issn.1001-411X.2014.03.005.html

李 磊(1985—)，女，碩士研究生，E-mail:lilei1225@hotmail.com;通信作者:欒維民(1957—)，男，教授，博士，E-mail:luanweimin@yahoo.com.cn

國家自然科學基金(30901065);吉林省科技發展計劃項目(201205059);“十二五”吉林省教育廳科學技術研究項目(2011431)

李 磊，張英楠，楊樹寶，等.雞嗉囊中淋巴細胞發育的研究［J］.華南農業大學學報，2014，35(3)：24-29.