基于CO I基因全長序列的假眼小綠葉蟬地理種群遺傳分化研究

周寧寧, 王夢馨, 崔 林, 潘 鋮, 張新亭, 韓寶瑜

(中國計量學院浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室， 杭州 310018)

假眼小綠葉蟬Empoascavitis(G?the) 隸屬于半翅目(Hemiptera) 、葉蟬科(Cicadellidae)、小綠葉蟬屬(Empoasca)，廣泛分布于我國大陸茶區，繁殖快，世代重疊嚴重，抗藥性強，防治難度大，是我國茶樹上為害最重的害蟲。常年假眼小綠葉蟬可致長江中下游茶區夏、秋茶減產10%—15%，嚴重發生年份達50%以上[1]。研究者們對于假眼小綠葉蟬生物學習性、地理分布、危害損失估計和防治等進行了深入的研究[2- 3]，但關于其地理種群遺傳和分化情況的報道甚少，僅應用 RAPD-PCR 技術鑒定了茶園小綠葉蟬類的優勢種[4]。我國幅員遼闊，茶樹廣泛種植于秦嶺淮河以南的祖國南半壁，各茶區的自然地理條件差別大，茶樹種植制度不同，可以造就不同地理區域的種群或生態型；另一方面，假眼小綠葉蟬成蟲善爬善跳還具有一定的飛行能力，若蟲也善于爬行和跳躍，成、若蟲能適應各種茶園生境。如果這種非遠距離的擴散連續地或漸次地發生，則有可能使得不同地理區域的種群發生基因交流[5]。

隨著分子系統地理學的發展，分子標記技術越來越多地應用到分子系統學研究中。mtDNA具有嚴格遵循母系遺傳，不發生重組、倒位、易位等突變現象以及進化速率快等特點，而常被用于分析昆蟲物種間及物種內種群的分化程度[6- 7]。COI基因是線粒體蛋白編碼基因之一，密碼子第三位堿基可相對自由變異[8]。且COI的演化速率是其他線粒體蛋白編碼基因的3倍，兩端序列相對保守，是較好的分子標記[9- 10]，已被用于研究玉米黃翅葉蟬Dalbulusmaidis、黃條脊冠葉蟬Aphrodesleafhoppers等葉蟬的遺傳多樣性[11- 12]。

目前主要以COI基因的部分序列進行遺傳多樣性研究。本實驗首次擴增得到我國13個主要茶葉種植省份的茶園假眼小綠葉蟬線粒體COI基因的全長序列，通過滑動窗口分析確定其突變位點的分布，并發現了茶園假眼小綠葉蟬線粒體COI基因存在不完整的終止密碼子。再利用此序列分析了茶園假眼小綠葉蟬種群間的遺傳多樣性、遺傳分化程度、基因流水平及分子變異情況等，以探討長期的地理阻隔對其種群遺傳特性的影響及其生態適生性、以及該葉蟬自身擴散和人工助遷等因素造成的種群變異，為針對不同地理區域假眼小綠葉蟬種群的控制策略提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試蟲源

本實驗所用茶園假眼小綠葉蟬，在2011年10月—2013年10月期間采集于山東青島、河南西九華山、江蘇蘇州、安徽敬亭山、湖北英山、四川樂山、重慶永川、江西婺源、浙江蘭溪、湖南長沙、福建武夷山、廣西桂林、和云南勐海等13個產茶省的重點產茶縣市，詳情見表1。采集的成蟲和若蟲浸泡于無水乙醇中，放置于-20℃長期保存備用。

1.2 基因組DNA的提取

取單頭假眼小綠葉蟬，放在加有適量液氮的1.5 mL離心管中，用無菌的研磨棒磨成粉末，采用動物組織快速提取試劑盒(VWI)，按照試劑盒說明書步驟進行基因組DNA提取。從提取的DNA樣品中取1 μL用Nanodrop 2000c 儀器(Thermo Scientific公司)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和純度，基因組DNA保存于-20℃備用。

1.3 CO I基因全長擴增和序列測定

根據葉蟬科線粒體COI基因兩端的保守區域，設計特異性引物用于擴增COI基因全長序列(擴增產物包括COI基因兩端的側翼序列，5′包括基因NADH 脫氫酶亞基2的部分序列，以及tRNATrp、tRNACys、tRNATyr3個相連的tRNA序列；3′端包括tRNALeu(UUR)序列以及COII基因部分序列)。引物序列：COI-F(正向引物)：5′- AACAACAGC TTTCTAGAAATTTGC- 3′,COI-R(反向引物)：5′-TTCCATAGTTGGTGAAGAAGC- 3′。擴增片段的長度約為1773 bp。

表1 假眼小綠葉蟬地理種群采集信息及供試個體數量

1.4 數據整理與分析

測序結果通過Chromas軟件讀取，用DNAMAN7.0對序列進行編輯，去除兩端的側翼序列。用Clustal X 1.8軟件進行多序列同源比對，并輔以人工校對，生成用于MEGA5.1軟件分析的數據格式[13]。將整理后的序列在NCBI網站上進行BLAST比對，確定目標序列。使用MEGA5.1軟件分析堿基組成、變異位點及堿基轉換顛換比；基于Kimura- 2-Parameter模型計算種群間的遺傳距離；以琉璃葉蟬HomalodiscavitripennisCOI基因全長序列作為外群，采用NJ鄰接法構建單倍型系統發育樹，系統發育樹各分支的置信度(bootstrap)均進行1000次重復檢驗[14]。采用NETWORK4.6.1.2軟件繪制單倍型間的進化網絡圖[15]。利用DnaSP5.0軟件分析13個種群內的單倍型多樣性Hd、核苷酸多樣性Pi、核苷酸平均差異數k，種群間核苷酸平均差異數Kxy、核苷酸歧義度Dxy、遺傳分化系數Gst與固定系數Fst等分子遺傳學系數，同時生成滑動窗口，分析突變位點在全長序列中的分布，并進行Tajima′sD中性檢驗[16- 17]。應用Arlequin 3軟件進行AMOVA分子變異分析，判斷遺傳分化的主要來源是種群內或種群間[18]。通過GenALEx 6.41軟件檢驗種群間的遺傳距離與地理距離的自然對數矩陣之間的相關性[19]。

2 結果與分析

2.1 茶園假眼小綠葉蟬線粒體CO I基因全長序列及滑動窗口分析

通過整理去除測序結果兩端側翼序列，得到茶園假眼小綠葉蟬線粒體COI基因全長序列，為1534 bp。該基因沒有完整的終止密碼子，最后一個堿基為T。從已報道的研究中可知，許多半翅目昆蟲，如琉璃葉蟬Homalodiscavitripennis(GenBank登錄號：NC_006899.1)、青蛾蠟蟬Geishadistinctissima(GenBank登錄號：NC_012617.1)[20- 21]以及紅頭鳳沫蟬Paphnutiusruficeps(GenBank登錄號：NC_021100.1)[22]，其線粒體COI基因以不完全終止密碼子(T)作為停止信號，與本研究所得結果一致。在13個種群176個個體中共發現突變位點113個，約占全長的7.37%，其中有7個位點的突變引起了氨基酸的改變(359，798，967，1175，1316，1330，1422)。單一多態位點40個，簡約信息位點73個，未發現堿基缺失或插入現象。由表2可知，在所有核苷酸替換中，轉換的發生頻率占87.61%，而顛換僅占12.39%。其中腺嘌呤(A)與鳥嘌呤(G)之間的轉換占總轉換數的30.8%，胞嘧啶(C)與胸腺嘧啶(T)之間的轉換占56.81%，值得注意的是，T轉換為C的比例高達43.68%?？傮w轉換/顛換偏倚率R值為7.01。據研究發現，通常親緣關系較近的分類階元之間核苷酸替換主要為轉換，而在親緣關系較遠的分類階元之間，核苷酸替換率則以顛換為主[23- 24]。本研究發現茶園假眼小綠葉蟬種內線粒體COI基因核苷酸突變位點的變異類型以轉換為主，驗證了上述規律。

表2 假眼小綠葉蟬CO I基因堿基替換情況

通過軟件DnaSP5.0滑動窗口分析COI全長序列，結果見圖1。從圖中可以看到，序列間的突變位點在絕大部分區段內均有分布。其中，在400 bp左右、700 bp到800 bp之間，1200 bp和1300 bp左右有較多的突變位點；前200 bp，900 bp左右，1100 bp左右的突變位點較少。由此可見，與使用基因的部分序列進行遺傳分化分析相比，使用序列的全長能夠包含更豐富的信息。

圖1 序列間突變位點的滑動窗口分析

2.2 茶園假眼小綠葉蟬CO I基因單倍型系統進化分析

從已獲得的176條COI基因全長序列中定義了105種單倍型：Hap1—Hap105。其中Hap5為共享單倍型，在所有種群中出現24次，占所有種群的13.64%。其余頻率較高的單倍型有：Hap16出現13次(7.39%)，Hap3和Hap26出現9次(5.11%)。在105種單倍型中，有84種單倍型是由單個種群所特有的獨享單倍型。由單倍型系統發育樹(圖2，圖中僅顯示大于30%的置信度值bootstrap)可以看出，在幾個大分支中置信度較低，說明這些單倍型之間的差異較小，不能形成可靠的分支。而各種群的單倍型分散在不同的分布群中，未形成明顯的系統地理結構。圖3是茶園假眼小綠葉蟬mtDNACOI基因105 種單倍型間的進化網絡圖，表現了各地理種群單倍型的分布情況，以及單倍型之間的演化關系。每種顏色代表一個種群的單倍型組成。沒有單倍型存在的那些節點是單倍型進化過程中的中間節點。單倍型Hap71在進化網絡的較為中心位置，而其他幾種出現頻率較高的單倍型則處于邊緣。由圖3中可以看到，各地理種群的單倍型散布于整個網絡圖中，每個種群由多種較為原始的單倍型演化產生的單倍型共同組成。說明種群間存在基因交流，分化程度較小。

2.3 茶園假眼小綠葉蟬不同地理種群的遺傳多樣性、種群間的基因流及遺傳分化分析

各種群COI基因單倍型、核苷酸多樣性分析及Tajima′sD中性檢驗結果如表2所示。由表可知，13個種群的總體單倍型多樣性指數Hd為0.9720，種群間核苷酸多樣性指數Pi為0.00607。種群內核苷酸多樣性在0.00413—0.00651范圍內，平均為0.00546。其中單倍型多樣性最高的種群是福建武夷山(FJWYS)，而云南勐海(YNMH)最低。核苷酸多樣性最高和最低的種群分別為湖南長沙(HNCS)和安徽敬亭山(AHJTS)。

圖2 利用鄰接法構建的假眼小綠葉蟬不同地理種群CO I單倍型間的系統發育樹

對各個地理種群的茶園假眼小綠葉蟬COI基因全長序列基于Tajima′sD值進行中性檢驗(表3)，檢測結果均不顯著，全部種群均為P>0.10，說明茶園假眼小綠葉蟬種群的進化過程遵循中性進化模型，各地理種群在進化過程中沒有出現群體擴張，群體大小保持相對穩定。

表3 假眼小綠葉蟬CO I基因單倍型、核苷酸多樣性分析及Tajima′s D中性檢驗

圖3 105 種 mtDNA CO I基因 單倍型的進化網絡關系

應用DnaSP5.0軟件計算反映茶園假眼小綠葉蟬種群間基因差異程度的遺傳學參數。各種群間核苷酸差異數Kxy在6.47778—13.37500之間，均值為8.98383；核苷酸歧義度Dxy在0.00422—0.00872之間，均值為0.00586(表4)。各地理種群總遺傳分化系數Gst為0.03652，總固定系數Fst為0.10876，總基因流Nm為4.097，固定系數Fst在-0.04168—0.43061之間。其中云南勐海(YNMH)種群與其他種群的遺傳分化程度最大(表5)。說明種群間分化程度低，基因交流頻繁。

通過AMOVA分子變異分析結果可以看出，不同地理種群之間的變異方差組分為0.59490(占方差比率的12.66%)，而種群內的方差組分為4.10510(占方差比率的87.33%)且差異顯著(P<0.05)(表6)。說明這13個茶園假眼小綠葉蟬地理種群的遺傳分化主要來自于種群內部，種群間的差異較小。

從表7可知，各個地理種群之間的遺傳距離在0.0042—0.0088之間。應用Mantel相關性檢驗計算兩個矩陣之間的相關系數r為-0.0697(P=0.5373>0.05，1000次隨機抽樣)，表明這兩個矩陣之間沒有顯著的相關性，即不同種群之間的遺傳分化程度與地理隔離沒有顯著關系。

3 討論

同行專家們也發表了少量關于茶園葉蟬類種群分化和基因流的研究報道。在印度茶小綠葉蟬EmpoascaflavescensF. 是茶樹上的優勢種，印度孟加拉邦的茶小綠葉蟬因茶園管理模式的不同引起了種群的遺傳分化[26]。在普通茶園中主要依靠噴施化學農藥進行防治，而有機茶園主要依靠茶樹品種的抗蟲性與施用微生物農藥防治，在這兩種管理模式下，茶小綠葉蟬面臨不同的選擇壓力，造成了不同管理模式的種群間差異大于相同管理模式下的種群間差異。在我國也有關于茶園假眼小綠葉蟬種群分化的初步研究，采用RAPD分子標記技術，探討了我國7個省份的茶園假眼小綠葉蟬的遺傳差異及其親緣關系[4]。

基于前人的相關成果，本研究采用線粒體COI基因全長序列，對我國主要產茶省份的茶園假眼小綠葉蟬不同地理種群的遺傳多樣性、遺傳分化程度、基因流水平及分子變異進行了解析，建立了單倍型系統發育樹和進化網絡圖。依據幾十年來的茶園葉蟬類發生和為害觀察、標本收集及鑒定，茶園中約有10余種葉蟬，但優勢種是假眼小綠葉蟬，其個體數占茶園葉蟬個體數的99.99%以上[27]，這個百分率很穩定，不隨時間、地點的變化而改變，本研究的供試蟲態都是成蟲，供試標本采集時間從2011年10月至2013年10月，采到的標本立即浸入無水乙醇中，數小時之后就保存于-20℃備用，可盡量消除采集時間因素對于試驗結果的影響。在13個種群176個個體中共發現突變位點113個，核苷酸替換以轉換為主。突變位點在整個區段內均有分布，但不同位置的進化速率有所不同。共產生105種單倍型，具有較高的單倍型多態性。其中單倍型Hap5為共享單倍型，這種單倍型可認為是能夠適應環境變化并在種群中穩定存在的優勢單倍型，該單倍型很有可能就是祖先單倍型[28- 29]；在所有的單倍型中，有84種是獨享單倍型，是由單個種群所特有的。各地理種群內具有較為豐富的單倍型多樣性，表明茶園假眼小綠葉蟬對于不同環境具有較強的生存能力，這與假眼小綠葉蟬廣泛存在于各種茶園環境中的情況一致。從單倍型系統發育樹來看，單倍型的分布與其所在的地理單元之間不存在明顯的對應關系。Tajima′sD檢驗是基于種內多態性的一種中性檢驗方法，可反映出物種種群變化動態的歷史。統計值為正值時說明序列進化方式為平衡選擇，且有一些單倍型分化；負值時為負向選擇，種群的擴張存在瓶頸效應。本實驗中總群體和各個地理種群的檢測結果均不顯著，說明茶園假眼小綠葉蟬種群的進化過程遵循中性進化模型，過去沒有出現群體擴張和持續性增長，群體大小保持相對穩定[17]。固定系數Fst是一種種群間遺傳距離的測度參數[30]，從本實驗的Fst值上看不同地理種群之間存在一定程度的遺傳分化?；蛄骷慈后w間基因交流，是種群遺傳結構均質化的主要因素之一，具有高水平基因流的種群間往往比具有有限基因流的種群間的遺傳分化程度小[31]。本實驗中總基因流Nm為4.097>4，當Nm>4時，種群間的基因交流比較充分，均質化作用足以抵制遺傳漂變的作用，一定程度上抵消種群間的遺傳分化[32]。通過AMOVA分子變異分析可以看出，假眼小綠葉蟬的遺傳分化主要來自于種群內部，種群間的差異較小。通過Mnatel檢驗可知，不同種群之間的遺傳分化程度與地理距離沒有顯著關系。

表4 假眼小綠葉蟬成對種群間的核苷酸平均差異數 (Kxy) (上三角) 與核苷酸歧義度(Dxy)(下三角)

表5 假眼小綠葉蟬成對種群間的遺傳分化系數 (Gst) (上三角) 與固定系數(Fst)(下三角)

表6 假眼小綠葉蟬13個地理種群CO I基因全長序列的分子變異分析

表7 假眼小綠葉蟬13個地理種群的地理距離自然對數值(km) (上三角)與遺傳距離(下三角)

綜上所述，認為假眼小綠葉蟬種群的進化過程遵循中性進化模型，群體大小保持相對穩定，這與茶園中假眼小綠葉蟬每年保持高發生量的情況相吻合，因為許多茶區每年假眼小綠葉蟬發生時間、發生量和施藥次數基本不變，每年都是10多次。假眼小綠葉蟬種群間存在一定程度的遺傳分化，這是因為我國幅員廣大，不同茶園所在的自然地理條件存在較大差異，不同地理種群之間的假眼小綠葉蟬可能存在著生物學和生態學特征的差異而有一定遺傳分化。而較為充分的基因交流帶來的均質化作用，在一定程度上抵消了種群間的遺傳分化。種群間假眼小綠葉蟬充分的基因交流主要源于假眼小綠葉蟬自然遷移和人為傳播兩方面的原因。假眼小綠葉蟬成蟲本身具有一定的飛行擴散能力，能適應各種地理環境，這種近距離的擴散行為一直在進行中，能夠引起不同種群間一定程度的基因交流。相比于茶園假眼小綠葉蟬的自然遷移，人為助遷的作用十分突出。在許多茶人們的印象中，20世紀50年代省際茶區之間假眼小綠葉蟬的體色等特征是有差異的，可能意味著大尺度的自然地理景觀條件下該葉蟬種群存在生態型的差異。然而，20世紀90年代以后，省內茶區之間、省際之間茶樹鮮葉的異地加工十分活躍，幫助了茶園假眼小綠葉蟬的大規模遷移，比如，近些年來從早春至深秋，黔、川、渝、皖南、豫南茶區鮮葉源源不斷地調往浙、蘇茶區加工以獲得高價出售，這些鮮葉夾帶了大量的假眼小綠葉蟬成蟲、若蟲和卵，它們隨著茶樹鮮葉在1—3日內遷移幾百—幾千km；閩南、閩北茶區茶苗不斷調往浙、蘇南、皖南、魯南和豫南等茶區，浙西茶區的安吉白茶茶苗持續調往周邊各省茶區。到達新區的假眼小綠葉蟬很快適應了當地茶園環境，經過幾百代的世代更替，使得假眼小綠葉蟬不同地理種群生態型的差異逐漸消失。這也解釋了為何假眼小綠葉蟬的遺傳分化主要來自于種群內部、種群間的差異較小、以及種群之間的遺傳分化程度與地理距離沒有顯著關系。

需要一提的是：來自西南邊陲的云南勐海種群(YNMH)在所有種群中單倍型多樣性Hd最小，與其他種群的遺傳分化程度最大，與其他種群之間的遺傳距離也最大，而除云南以外其他種群之間的差異比較一致。這說明了云南的茶園假眼小綠葉蟬相比較于其他種群來說處于一個相對封閉的環境中，與其他種群基因交流較小。這是因為云南的茶樹多為喬木型、半喬木型，茶園地理環境、氣候和植被、以及茶葉內含物等顯著區別于其他假眼小綠葉蟬種群所在茶區的相應因素。而且采集YNMH種群的云南的茶園處于原始森林，交通不便、人跡罕至，該假眼小綠葉蟬種群較為獨立，與其他種群的交流較少。

本研究首次擴增得到茶園假眼小綠葉蟬COI基因的全長序列，并將其應用到種群間的遺傳分化研究中。與使用COI基因的部分序列進行遺傳分化分析相比，使用序列的全長包含了更豐富的信息，獲得了充分的變異位點及較為全面的遺傳學數據。在下一步的研究中，還需要配合其他分子標記，比如線粒體的控制區以及核基因上的分子標記，增加試驗采樣點及樣本數量，進一步加深對中國茶園假眼小綠葉蟬種群間關系及遺傳機制的研究。

:

[1] Wang Q S, Wang D F, Wu G Y. Research advances onEmpoascavitis(G?the) in tea trees in China. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2013, 28(6): 615- 623.

[2] Wang Y G, Li L J, Ran L X, Yu X S, Wu W W, Han B Y, Li Z M. Investigation on population dynamics ofEmpoascavitis(G?the) of different planting patterns. Southwest China Journal of Agricultural Science, 2010, 23(2): 413- 415.

[3] Liu L F, Xu D L, Mu D, Han B Y. Analysis of the feeding behaviours of tea green leafhoppers on resistant to sensible cultivars of tea plants by electrical penetration graphy techniques. Journal of Anhui Agricultural University, 2011, 38(2): 281- 286.

[4] Fu J Y, Han B Y. Studies on genetic relationships among populations ofEmpoascavitis(G?the) from tea gardens in seven provinces based on RAPD analysis. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2007, 19(1): 11- 14.

[5] Johnson K B, Radcliffe E B, Teng P S. Effects of interacting populations of Alternaria solani, Verticillium dahliae, and the potato leafhopper (Empoascafabae) on potato yield. Phytopathology, 1986, 76: 1046- 1052.

[6] Wang D M, Lin Y. Application of mitochondrial DNA gene order in molecular systematics of insects. Guangdong Journal of Agricultural Sciences, 2010, 37(6): 188- 190.

[7] Wang B X, Yang L F. Phylogenetic utilites of mitochondrial DNA sequences in the study of insect systematic. Entomological Knowledge, 2002, 39(2): 88- 92.

[8] Lv H J, Huang Y. Phylogenetic relationship among some groups of orthopteran based on complete sequences of the mitochondrial COI gene. Zoological Research, 33(3): 319- 328.

[9] Pavan-Kumar A, Gireesh-Babu P, Babu P S, Jaiswar A K, Krishna V H, Prasasd K P, Chaudhari A, Raje S G, Chakraborty S K, Krishna Gopal, Lakra W S. Molecular phylogeny of elasmobranchs inferred from mitochondrial and nuclear markers. Molecular Biology Reports, 2014, 41(1): 447- 457.

[10] Zanol J, Halanych K M, Struck T H, Fauchald K. Phylogeny of the bristle worm family Eunicidae (Eunicida, Annelida) and the phylogenetic utility of noncongruent 16S,COIand 18S in combined analyses. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2010, 55(2): 660- 676.

[11] Palomera V, Bertin S, Rodríguez A, Bosco D, Virla E, Moya-Raygoza G. Is there any genetic variation among native mexican and argentinian populations ofDalbulusmaidis(Hemiptera: Cicadellidae)? Florida Entomologist, 2012, 95(1): 150- 155.

[12] luemel J K, Andrew K R, Virant-Doberlet M, Symondson W O C. Primers for identification of type and other archived specimens ofAphrodesleafhoppers(Hemiptera, Cicadellidae). Molecular Ecology Resources, 2011, 11(5): 770- 774.

[13] Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins D G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research, 1997, 25(24): 4876- 4882.

[14] Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4. 0. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24(8): 1596- 1599.

[15] Polzin T, Daneshmand S V. On Steiner trees and minimum spanning trees in hypergraphs. Operations Research Letters, 2003, 31(1): 12- 20.

[16] Librado P, Rozas J. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics, 2009, 25(11): 1451- 1452.

[17] Tajima F. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism. Genetics, 1989, 123(3): 585- 595.

[18] Excoffier L, Laval G, Schneider S. Arlequin (version 3. 0): an integrated software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online, 2007, 1: 47- 50.

[19] Peakall R, Smouse P E. GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes, 2006, 6(1): 288- 295.

[20] Song N, Liang A P. The complete mitochondrial genome sequence ofGeishadistinctissima(Hemiptera: Flatidae) and comparison with other hemipteran insects. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2009, 41(3): 206- 216.

[21] Bengtsson-Palme J, Ryberg M, Hartmann M, Branco S, Wang Z, Godhe A, De Wit P, Sánchez-García M, Ebersberger I, de Sousa F, Amend A, Jumpponen A, Unterseher M, Kristiansson E, Abarenkov K, Bertrand Y J K, Sanli K, Eriksson K M, Vik U, Veldre V, Nilsson R H. Improved software detection and extraction of ITS1 and ITS2 from ribosomal ITS sequences of fungi and other eukaryotes for analysis of environmental sequencing data. Methods in Ecology and Evolution, 2013, 4(10): 914- 919.

[22] Liu J, Liang A P. The complete mitochondrial genome of spittlebugPaphnutiusruficeps(Insecta: Hemiptera: Cercopidae) with a fairly short putative control region. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2013, 45(4): 309- 319.

[23] Simon C, Frati F, Beckenbach A, Crespi B, Liu H, Flook P. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the Entomological Society of America, 1994, 87(6): 651- 701.

[24] Frati F, Simon C, Sullivan J, Swofford D L. Evolution of the mitochondrial cytochrome oxidase II gene in Collembola. Journal of Molecular Evolution, 1997, 44(2): 145- 158.

[25] Slatkin M. A measure of population subdivision based on microsatellite allele frequencies. Genetics, 1995, 139(1): 457- 462.

[26] Saha D, Mukhopadhyay A, Bahadur M. Genetic diversity ofEmpoascaflavescensFabricius (Homoptera: Cicadellidae), an emerging pest of tea from sub-himalayan plantations of West Bengal, India. Proceedings of the Zoological Society, 2012, 65(2): 126- 131.

[27] Zhao D X, Chen Z M, Cheng J A. Belongingness of tea leafhopper dominant species. Journal of Tea Science, 2000, 20(2): 101- 104.

[28] Wen L Y, Zhang L X, Liu N F. Phylogenetic relationship ofPerdixdauuricaeinferred from mitochondrial Cytochrome b gene. Zoological Research, 2005, 26(1): 69- 75.

[29] Li J B, Ren Z M. Genetic diversity among schlechtendalia chinensis individuals revealed by Cyt b sequences. Journal of Fudan University: Natural Science, 2009, 48(5): 680- 686.

[30] Rousset F. Genetic differentiation and estimation of gene flow from F-statistics under isolation by distance. Genetics, 1997, 145(4): 1219- 1228.

[31] Millar C I, Libby W J. Strategies for conserving clinal, ecotypic, and disjunct population diversity in widespread species // Genetics and Conservation of Rare Plants. New York: Oxford University Press, 1991: 149- 170.

[32] Whitlock M C, McCauley D E. Indirect measures of gene flow and migration: FST≠1/(4Nm+1). Heredity, 1999, 82(2): 117- 125.

參考文獻:

[1] 王慶森, 王定鋒, 吳光遠. 我國茶樹假眼小綠葉蟬研究進展. 福建農業學報, 2013, 28(6): 615- 623.

[2] 汪云剛, 李良靜, 冉隆珣, 玉香甩, 吳文偉, 韓寶瑜, 李忠美. 不同種植模式下茶假眼小綠葉蟬種群動態的調查. 西南農業學報, 2010, 23(2): 413- 415.

[3] 劉麗芳, 徐德良, 穆丹, 韓寶瑜. EPG 技術分析不同品種茶樹抗假眼小綠葉蟬取食行為的差異. 安徽農業大學學報, 2011, 38(2): 281- 286.

[4] 付建玉, 韓寶瑜. 七省茶園假眼小綠葉蟬的 RAPD 分析及其親緣關系探討. 浙江農業學報, 2007, 19(1): 11- 14.

[6] 王德明, 林楊. 線粒體DNA基因序列在昆蟲分子系統學研究中的應用. 廣東農業科學, 2010, 37(6): 188- 190.

[7] 王備新, 楊蓮芳. 線粒體DNA序列特點與昆蟲系統學研究. 昆蟲知識, 2002, 39(2): 88- 92.

[27] 趙冬香, 陳宗懋, 程家安. 茶小綠葉蟬優勢種的歸屬. 茶葉科學, 2000, 20(2): 101- 104.

[28] 文隴英, 張立勛, 劉迺發. 以mtDNA細胞色素b基因探討斑翅山鶉的分類地位. 動物學研究, 2005, 26(1): 69- 75.

[29] 李繼變, 任竹梅. 角倍蚜mtDNA Cyt b 基因遺傳多樣性分析. 復旦學報: 自然科學版, 2009, 48(5): 680- 686.