保暖風的薄層色譜鑒別及其紫丁香苷HPLC法含量測定

唐秀玲 唐秀利

1.廣西食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021;2.廣西壯族自治區柳州市柳鐵中心醫院，廣西 柳州 545007

保暖風為傳統瑤藥“五虎九牛十八鉆七十二風”之風藥，來源為瑞香科植物結香Edgeworthia chrysantha Lindl.的全株［1］。分布河南、陜西、長江流域及以南各省區，廣西各地均有分布［1-3］。保暖風味甘、性溫，歸腎、肝經，其根、莖、花可分別人藥，根和莖具有舒筋活絡，消腫止痛功效;花具有養陰安神、明目、祛障翳之功效［4］。為保護、收集、整理和發展廣西民間瑤藥資源，廣西食品藥品監督管理局擬出版《廣西瑤族習用藥材質量標準 (第一卷)》，對瑤族習用藥材進行質量控制指標研究，建立質量標準，保暖風是其中品種之一。

保暖風 (結香)化學成分研究報道［4-6］主要含香豆素類、黃酮類、甾類、有機酸化合物等，其中傘型花內酯、西瑞香素等成分含量測定方法已有報道［7］。本文采用7-羥基香豆素、紫丁香苷對照品及保暖風對照藥材作薄層色譜鑒別的對照，建立兩個薄層色譜鑒別，結果斑點圓整、清晰，重復性好;用高效液相色譜法測定紫丁香苷含量，采用甲醇回流提取制備供試品，用乙腈-水 (9∶91)為流動相，紫丁香苷與其它雜質峰分離良好，按照《中國藥典》2010年版一部附錄［8］“中藥質量標準分析方法驗證指導原則”進行方法學驗證，結果表明該方法專屬性強，穩定性、重現性好，結果可靠，可作為保暖風質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，2487紫外檢測器，Empower色譜工作站;MILLIPORE純水處理器;MIKRO 22R型高速冷凍離心機;梅特勒電子分析天平。

1.2 試藥 7-羥基香豆素 (批號:11739-200501)、紫丁香苷 (批號:111574-200201)購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為高純水，其它試劑均為分析純。保暖風分別采集于廣西金秀縣桐木鎮、資源縣兩水鄉、賀州市開山鎮、金秀縣長垌鄉、桂林市、金秀縣六巷鄉，柳州市鹿寨縣、桂林市龍勝縣、桂林市恭城縣等地，經鑒定為瑞香科植物結香Edgeworthia chrysantha Lindl。

2 薄層色譜鑒別

2.1 7 -羥基香豆素的鑒別 取保暖風粉末1g，加甲醇30ml，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取保暖風對照藥材1g，同法制定對照藥材溶液，再取7-羥基香豆素對照品適量，加甲醇制成每1ml含0.1mg溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法 (中國藥典2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液2～4μl、對品溶液1～2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚 (60～90℃)-乙酸乙酯 (6.5∶3.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加至斑點顯色清晰。置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色和對照品譜相應的位置上，顯相同的藍色熒光斑點，見圖1。

2.2 紫丁香苷的鑒別 取本品各2g，加甲醇50ml，超聲30分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25ml使溶解，加石油醚 (60～90℃)提取兩次，每次25ml，棄去石油醚液，再加三氯甲烷提取兩次，每次25ml，棄去三氯甲烷液，水液加水飽和的正丁醇提取兩次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取保暖風對照藥材2g，同法制定對照藥材溶液，再取紫丁香苷對照品適量，加甲醇制成每1ml含1mg溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法 (中國藥典2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液5～10μl、對品溶液2μl，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿-甲醇-甲酸 (6∶1.2∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外燈 (254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色和對照品譜相應的位置上，顯相同的斑點，見圖2。

3 紫丁香苷含量測定

3.1 色譜條件 色譜柱:SPOLAR C18(5μm，4.6mm×250mm);檢測波長:264nm;流速:1.0ml/min;柱溫:35℃，流動相:乙腈-水 (9∶91)，進樣量10μl。在上述色譜條件下，紫丁香苷峰形良好，與相鄰峰達到基線分離。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品溶液的制備 取紫丁香苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。

3.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末約1g，精密稱定，置燒瓶中，精密加甲醇50ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

3.3 穩定性考察 對同一供試品溶液 (BNF-5)，每隔一定時間測定一次，共測定9次，RSD為0.95%。試驗表明，在24小時內被測物穩定。

3.4 線性范圍考察 精密稱取紫丁香苷對照品10.33mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取 1.0、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0.、20.0ml，分 別 置50、20、20、20、20、20、20ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為不同濃度的對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液各10μl，按3.1色譜條件測定。以對照品進樣量為橫坐標 (X)，峰面積積分值為縱坐標 (Y)，繪制標準曲線，結果表明:紫丁香苷進樣量在0.04132～2.066μg范圍內，進樣量與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為:Y=2.5173×106X-3.0990×103，r=1.0000。

3.5 精密度試驗

3.5.1 儀器精密度試驗 取同一供試品溶液 (BNF-5)，按“3.1”色譜條件，連續測定6次，進樣量為10μl。結果6次測定結果紫丁香苷峰面積的平均值為902489，RSD為0.49%(n=6)。試驗表明，本法的精密度良好。

3.5.2 重復性試驗 取同一供試品 (BNF-5)，按擬訂的方法平行測定6份，結果紫丁香苷含量的平均值為1.76mg/g，RSD為1.6%(n=6)。果表明本法的重復性好。

3.6 準確度試驗 精密稱取已知含量的保暖風0.5g(BNF-5，紫丁香苷含量為1.7622mg/g)，共六份，分別精密加入紫丁香苷甲醇溶液 (紫丁香苷含量0.7710mg/ml)1ml，揮去甲醇，按“3.2.2”的方法提取、測定，計算加樣回收率，結果紫丁香苷的加樣回收率為101.2%，RSD=1.3%(n=6)，符合方法學的要求，詳見表1。

表1 加樣回收試驗結果

3.7 耐用性考察 用不同品牌色譜柱:SPOLAR C18(5μm，4.6mm × 250mm)、Alltima C18(5μm，4.6mm ×250mm)、XBridge C18(5μm，4.6mm ×250mm)進行分離、測定，結果紫丁香苷在上述色譜柱中均得到良好的分離，理論板數分別為5638、10368、5763。平均含量分別為1.76mg/g、1.78mg/g、1.77mg/g，RSD為0.56%。

3.8 樣品測定 按“3.2.1”、“3.2.2”制備對照品溶液和10批樣品溶液，照“3.1”項下色譜條件測定，按干燥品計算樣品中的紫丁香苷的含量。10批樣品中含量最高的是BNF-5為0.196%;含量最低的是BNF-6為0.023%。結果見表2。

表2 10批樣品測定結果

4 討論

4.1 供試品溶液制備方法的確定 本研究采用單因素試驗，對提取溶劑 (甲醇、乙醇)、提取方法 (超聲、回流)、提取溶劑的量 (15、25、50、100ml)和提取時間(15、30、60、90、120mim)依次進行考察，結果表明，甲醇25ml，加熱回流30分鐘，可提取完全。

4.2 測定波長的選擇 取紫丁香苷對照品溶液及供試品溶液，按以上色譜條件進樣，在反相高效液相色譜系統上實現對紫丁香苷的分離后，以二極管陣列檢測器測定它的紫外光譜圖，結果紫丁香苷對照品與保暖風樣品均在221nm和264nm處有最大吸收，由于221nm干擾較大，故選擇檢測波長為264nm。

4.3 所建立的薄層色譜方法及含量測定方法簡便快捷，重復性好，結果準確可靠，能有效控制保暖風的質量，可作為保暖風的質量標準的主要控制指標。

［1］戴斌.中國現代瑤藥［M］.廣西:廣西科學技術出版社，2009:233-235.

［2］江蘇新醫學院.中藥大辭典 (下冊)［M］.上海:上?？茖W技術出版社，1993:2080-2081.

［3］國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草 (第5冊) ［M］.上海:上?？茖W技術出版社，1999:415-416.

［4］徐玲，蔡正洪.結香的化學成分及藥理研究進展［J］.安徽農業科技，2011，39(31):19110-19111.

［5］盛柳青，顏繼忠，童勝強，等.結香莖皮化學成分的研究［J］.中國中藥雜志，2009，34(4):495-496.

［6］童勝強，顏繼忠，葉用君，等.結香花化學成分的研究［J］.時珍國醫國藥，2006，17(1):44-45.

［7］徐敏，顏繼忠，童勝強.結香莖皮中傘型花內酯和西瑞香素的RPHPLC法測定［J］.中草藥，2008，39(2):288-289

［8］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 (一部) ［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010.