焦磷酸測序法與Sanger測序法檢測CYP2C19*17基因多態性方法學對比研究

王謙，杜亞梅，張國軍，康熙雄

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焦磷酸測序法與Sanger測序法檢測CYP2C19*17基因多態性方法學對比研究

王謙，杜亞梅，張國軍，康熙雄

100050 北京，首都醫科大學附屬北京天壇醫院檢驗科

隨著個體化診斷與個性化用藥相關研究的進展，由 CYP2C19 引起的藥物氧化代謝個體差異和種族差異越來越引起臨床重視，大量內源性底物和臨床應用的大約 2% 的藥物均由 CYP2C19 催化代謝[1]，如對抗癲癇藥物[2]（丙戊酸和苯妥英鈉等）、質子泵抑制劑[3]（奧美拉唑、蘭索拉唑等）、抗抑郁藥[4]（西酞普蘭等）的代謝影響，其基因多態性是引起同一藥物在不同個體和種族間表現出不同代謝能力的主要原因之一[5]。其中，CYP2C19*2、CYP2C19*3 和 CYP2C19*17 在人群中所占比例較高，前兩者相對于酶的活性是下調作用，目前臨床檢測較為廣泛。而 CYP2C19*17 對酶的活性是上調作用，等位基因突變占亞洲人群比例為 5%。

焦磷酸測序技術是介于一代測序和二代測序之間的一種測序手段，它既摒棄了一代測序（如 Sanger 測序等）操作耗時、煩瑣、通量受局限的缺點，又避免了二代測序成本高、檢測 DNA 結果信息量過大、結果分析復雜等局限性[6]?；诮沽姿釡y序技術而研究開發的 PyroMark Q24 MDx 系統具有操作簡單、快速、靈敏度高、高通量等優點，在檢測單核苷酸多態性（SNP）位點、甲基化突變等基因變異中具有明顯的優勢。

本研究建立了操作簡單、快速、靈敏度高、高通量的檢測 CYP2C19*17 基因多態性的焦磷酸測序法，與經典的 Sanger 測序法作比對驗證了其準確性和重復性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究樣本 96 例隨機 EDTA 抗凝血樣本，來自無親緣關系的北京天壇醫院體檢科體檢人群。血樣采集后 4 h 內完成 DNA 的提取。

1.1.2 主要儀器設備 高速離心機購自美國 Sigma 公司；聚合酶鏈式反應儀購自美國 Thermal 公司；電泳儀購自 Tanon 公司；凝膠成像儀購自 Capital Biochip 公司；PyroMark Q24 MDx 焦磷酸測序儀購自德國 Qiagen 公司。

1.1.3 主要試劑 DNA 標本提取試劑盒為美國 Omega 公司產品；PCR 反應體系試劑為TransGen Biotech 公司產品；瓊脂糖為 Gene Tech 公司產品；焦磷酸測序試劑盒為德國 Qiagen 公司產品；Streptavidin Sepharose磁珠為瑞典 GE healthcare life sciences 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 人全血標本 DNA 提取 EDTA-K2 抗凝管采血，吸取全血 250 μl 于 1.5 ml 無菌 EP 管中，采用全血基因組 DNA 提取試劑盒提取 DNA。按照試劑說明書操作。提取結束后加入預熱到 65 ℃的洗出液150 μl 溶解，–20 ℃保存待用。

1.2.2 引物設計與合成 用 Pyromark Assay Design 2.0 和 primer 3 軟件共同設計用于 CYP2C19*17 擴增和測序的引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成引物。擴增上游引物：5' GTGATGGAGAAGGGAGAACTCTTA 3'，下游引物：5' ATCGTGGCGCATTATCTCTTAC 3'，。下游引物 5' 端由生物素修飾。產物為 254 bp。按如下條件進行 PCR 擴增：反應體系 50 μl，其中 2 × PCR Mix 25 μl，上下游引物各 4 μl，模板 2 μl，加 15 μl 水至 50 μl 體系。PCR 擴增條件如下：94 ℃變性 5 min，然后共 35 個循環（94 ℃ 30 s，58.2 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s），再經 72 ℃延伸5 min，最后在 4 ℃保溫。將部分 PCR 產物送去上海生工生物工程技術服務有限公司進行Sanger 測序。測序引物：5' TTGT GTCTTCTGTTCTCAA 3'。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 采用2% 瓊脂糖凝膠，將擴增產物5 μl 和 6 × 上樣緩沖液 1 μl 混勻加樣至配置時已加入溴化乙錠（EBr）取代液的凝膠孔中，水平電泳槽電泳。條件：電壓 120 V，25 min。電泳完畢后放置于凝膠成像儀內觀察電泳結果。

1.2.4 焦磷酸測序

⑴測序引物退火緩沖液的配制：將 10 μmol/L 測序引物工作液 1 μl 加入 24 μl 退火緩沖液中，得到 0.4 μmol/L 測序引物退火緩沖液。測序板上每個孔加入測序引物退火緩沖液 25 μl。

⑵配置單鏈DNA 分離液：2 μl 磁珠和 40 μl 結合緩沖液，加高純水 18 μl 配置成 60 μl 單鏈 DNA 分離液。

⑶PCR 產物固定：每個 PCR 樣本 20 μl 加入 60 μl單鏈 DNA 分離液，在常溫下劇烈振蕩 10 min，使得親和素包被的磁珠與生物素標記的單鏈充分結合。

⑷單鏈DNA 模板的制備：在真空工作站中，1 號位加入 70% 乙醇 50 ml，2 號位加入變性緩沖液40 ml，3 號位加入洗液 50 ml，4 號位加入高純水 50 ml，5 號位加入高純水 70 ml。打開真空泵，將真空工具在 6 號位清洗15 s，移動到 PCR 板吸附磁珠 15 s，依次在 1、2、3 號位清洗 5、5、10 s。

⑸引物雜交：將真空工具真空閥關閉，放入含有測序引物的板中，充分搖動釋放磁珠，在 80 ℃雜交 2 min，室溫靜置 5 min 冷卻。

⑹測序：使用焦磷酸測序儀和測序通用試劑盒，按儀器和試劑說明書進行 PCR 產物的 SNP 位點的焦磷酸測序。

1.2.5 突變類型分析 根據檢測出的堿基序列判斷突變類型：野生型（CYP2C19*17 *1/*1）-806 位點為 C/C；突變雜合子（CYP2C19*17 *1/*17）-806 位點為 C/T；突變純合子（CYP2C19*17 *17/*17）-806 位點為 T/T。

1.2.6 重復性實驗 檢測的 96 例標本，在 1 周內，相同樣本重復 3 次實驗。觀察 CYP2C19*17 突變檢出率和重復性。

2 結果

2.1 焦磷酸測序片段的 PCR 產物

將擴增產物 5 μl 和 6 × 上樣緩沖液1 μl 混勻，在 2%瓊脂糖凝膠電泳，獲得清晰的擴增產物，大小為 254 bp（圖 1）。

1：Marker；2：陰性對照；3 ~ 6：樣品

2.2 CYP2C19*17 突變位點的檢測

經真空工作站分離純化后所得的單鏈擴增產物，用焦磷酸測序儀測序，所得結果清晰顯示待測片段的 DNA 序列，信噪比極高。根據 NCBI 中查得的對應基因片段序列，由 CYP2C19*17 位點的堿基類型可以識別相應突變類型。與經典的 ABI 的Sanger 測序法的結果對比完全相符（圖 2）。

2.3 CYP2C19*17 突變位點基因型分析

在 96 例樣本的檢測中，CYP2C19*1 即野生型的頻率最高，共 94 例，占 97.9%，其次是 CYP2C19*17 雜合型，占 2.1%。

CYP2C19*1 野生型焦磷酸測序 CYP2C19*1 野生型 Sanger 測序

CYP2C19*17 突變雜合型焦磷酸測序 CYP2C19*17 突變雜合型 Sanger測序

圖 2 焦磷酸測序與 Sanger 測序結果對比圖

表 1 96 例健康體檢人群 CYP2C19*17 基因型頻率焦磷酸測序與 Sanger 測序結果比較

2.4 CYP2C19*17 突變位點檢測的可靠性分析

為了驗證焦磷酸測序法檢測 CYP2C19*17 的可靠性，選取 96 例標本進行批量檢測的重復性實驗。結果表明：在 3 次的重復實驗中，突變檢出率和重復性均為 100%（96/96）。另外將 96 例 DNA 樣本擴增產物進行 Sanger 測序，結果與焦磷酸測序的結果完全一致（表 1）。

3 討論

CYP450 酶系是人體重要的藥物代謝酶，CYP2C 作為 CYP450 一種重要的亞家族在人肝臟微粒體中約占 CYP450 的 20%，其中 CYP2C19*17 基因多態性對于臨床常用抗凝劑氯吡格雷的作用有顯著影響。CYP2C19*17 位于 CYP2C19 基因 5' 啟動子區的側翼序列第 -806 位點堿基 C > T 多態性，含-806C > T 的調控元件可結合肝核蛋白，從而加快 CYP2C19 的轉錄速率，提高酶的催化活性，使得氯吡格雷的活性代謝產物增多，從而增強了氯吡格雷抗血小板作用，同時也提高了出血風險。該 SNP 位點可為個體化用藥提供參考，實現個體化治療[7-8]。

焦磷酸測序是基于酶級聯放大反應的邊合成邊測序的實時測序技術。根據可見光信號的有無判斷核苷酸是否滲入，根據光信號的強弱判斷核苷酸滲入的數量。該技術平臺檢測項目靈活，可以通過設計實現同一批次多個項目檢測，可用于檢測的項目有 SNP 分型、甲基化分析、微生物鑒定及耐藥性分析、已知特定的 DNA 位點變化等。同時，本方法測序快速，在 PCR 后僅需半個小時完成單鏈的制備和測序全部工作，得出對應的基因型。從處理血樣到得出結果也僅需四個半小時。同時，焦磷酸測序檢測成本較低、通量相對較高、靈敏度高，適合臨床常規檢測的推廣。

本研究建立了 CYP2C19*17 多態性位點的焦磷酸測序檢測方法，能夠快速準確地檢測患者的基因型，為臨床個性化用藥提供參考。本實驗對 96例健康體檢人群進行的 CYP2C19*17 突變位點檢測，突變雜合型占 2.1%，低于文獻[9]報道的 4%，未發現突變純合型，可能與標本量相對少，取樣人群不同有關，人群中所占基因頻率有待進一步大樣本驗證。與傳統的 Sanger 測序法比較，本檢測方法的準確性達到 100%，短期內重復檢測 3 次結果一致，重復性 100%。焦磷酸測序法是一種準確性高、重復性好、操作簡單快速的檢測方法，經進一步驗證可在臨床開展應用檢測。目前，氯吡格雷在短暫性腦缺血發作或小卒中后相對短期應用于降低卒中復發風險方面的作用越來越受到重視[10]，建立綜合評價氯吡格雷用藥體系還需要深入研究。

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康熙雄，Email：kangxx@vip.sina.com

2013-12-24

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.012