氯化鈷預處理對大鼠脂肪干細胞成脂及增殖的影響

黃佳誠, 柳大烈, 黃子龍, 南 華

實驗研究

氯化鈷預處理對大鼠脂肪干細胞成脂及增殖的影響

黃佳誠, 柳大烈, 黃子龍, 南 華

目的觀察脂肪來源間充質干細胞(ADSCs)在經氯化鈷(CoCl2)預處理的條件下，其增殖、細胞狀態變化以及成脂肪化傾向。方法通過有限稀釋法分離、培養SD大鼠ADSCs，取第3代ADSCs，分別向骨細胞、脂肪細胞定向誘導分化鑒定，利用流式細胞儀檢測大鼠ADSCs細胞表面標志物CD29，CD34，CD44，CD45的表達。將ADSCs經不同濃度CoCl2干預,利用Western blot檢測缺氧誘導因子1α(HIF-1α)的表達情況。同時，利用MTT實驗來檢測大鼠ADSCs在不同濃度的CoCl2下細胞增殖的改變；并且通過油紅O定量檢測大鼠ADSCs在經歷缺氧后的成脂情況。結果第3代ADSCs在倒置顯微鏡下觀察，大多呈梭形,經流式鑒定，大鼠ADSCs細胞表面標志物CD29、CD44表達率高，而CD34、CD45表達率低，體外誘導培養的大鼠ADSCs能夠向成骨細胞和成脂細胞分化，具有較高的自我更新能力。在MTT實驗中，400、200 μmol/L CoCl2組，ADSCs增值減弱；而100、50 μmol/L CoCl2的實驗組，缺氧造成的對細胞增殖和細胞毒性與空白對照組相比，沒有變化(P>0.05)。HIF-1α的表達隨著培養基中的CoCl2的濃度而增加。在光鏡下觀察發現，隨著CoCl2濃度的升高以及時間的延長，大鼠ADSCs的成脂傾向越發明顯(P<0.001)。結論ADSCs在處于體外適量的CoCl2干預情況時，其增殖并不會受到影響，并且呈顯著的增強其成脂傾向。

脂肪來源干細胞； 氯化鈷； 成脂分化

自體脂肪組織抽吸注射移植術是常見的整形手術，有關提高脂肪成活率的研究一直是脂肪移植術中的重點。有學者提出脂肪移植術后脂肪吸收率較高的原因可能是由于脂肪組織移植后，脂肪細胞處于一個相對局部缺氧的環境從而導致其壞死、液化[1]。一些研究表明，在移植的脂肪組織中加入事先培養好的脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)可以達到更好的臨床效果[1-2]。氯化鈷(CoCl2)是一種成熟的缺氧模型制造劑，已被廣泛用于制作體外和體內細胞缺氧的環境[3-6]。自2013年2-8月，我們通過ADSCs經由一個梯度的CoCl2的濃度體外培養，檢測ADSCs在該環境下培養時缺氧誘導因子-1α(hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α)的表達，并通過MTT實驗及油紅O染色定量檢測，觀察隨著缺氧程度及缺氧時間的改變，脂肪干細胞增殖能力及成脂趨勢的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

SD成年大鼠(南方醫科大學實驗動物中心提供)；Ⅰ型膠原酶、地塞米松、胰島素、β-甘油磷酸鈉、維生素C、1- 甲基-3- 異丙基黃嘌呤、吲哚美辛、DMEM-F12、胎牛血清(FBS)、細胞表面抗原檢測用試劑鼠抗人CD29-PE、CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC(美國BIOLEGEND公司)；兔抗鼠單克隆抗體HIF-1α(美國SANTA CRUX公司)；CoCl2(美國SIGMA公司)；Olympus倒置顯微鏡, HERUS CO2培養孵箱, 超凈工作臺,低溫離心機, BD FACS Calibur 流式細胞儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠ADSCs的獲取 無菌條件取大鼠腹股溝脂肪墊, 用PBS沖洗,超凈臺內切碎后用加入0.1%Ⅰ型膠原酶吸管反復吹打,37 ℃孵育45 min, 加入基礎培養基終止消化, 離心, 重懸細胞, 150目篩網過濾；再次離心后，重懸細胞，并將細胞懸液移入培養瓶中, 置37 ℃、5%CO2條件下靜置培養。24 h后即可見到有少量細胞貼壁；48 h后換液, 5～7 d 細胞長滿瓶底后胰酶消化，擴大培養。

1.2.2 ADSCs的流式細胞儀鑒定 取培養至3代的細胞，PBS洗1遍，計數，1×106/管分裝5管，抗體用0.1%BSA稀釋，100 μl/管，抗體室溫避光孵育1 h。流式細胞儀檢測ADSCs表面抗原的表達。

1.2.3 ADSCs多向分化能力的檢測 選取第3 代ADSCs 接種到6孔板, 每皿5×104/ml細胞, 在37℃、5%CO2條培養24 h后，分別加入成骨誘導劑(0.1 μmol/L地塞米松、50 mg/L維生素C、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉)或成脂誘導劑(0.25 μmol/L地塞米松、50 μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L牛胰島素)，對照組為單純含10%FBS的培養基。每3 d換液，分別于7 d和28 d后，用茜素紅鈣鹽染色法及油紅O染色法來測定ADSCs的多向分化能力。

1.2.4 MTT檢測不同濃度的CoCl2對細胞增殖的影響 選取第3代ADSCs接種到96孔板，每孔2000個細胞，在37 ℃、5%CO2條培養24 h后，分別加入CoCl2使得每個孔中CoCl2的濃度分別為0、50、100、200、400 μmol/L，并設置校零孔。然后分別在加藥6、24、48、72 h后加入20 μl的MTT試劑，然后通過酶標儀測得其在490 nm下的OD值。

1.2.5 Western blot檢測不同組中HIF-1α蛋白表達

提取各組中的ADSCs蛋白，定量后添加SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸7 min，每組上樣20 μg，經10%SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜，5%的脫脂奶4 ℃封閉2 h，兔抗鼠HIF-1α(1∶1000) 4 ℃過夜，羊抗兔近紅外二抗4 ℃避光封閉2 h，Odyssey近紅外成像系統中掃描、分析。

1.2.6 選取第3 代ADSCs 接種到6孔板, 每皿5×104/ml細胞, 在37 ℃、5%CO2條件培養24 h后，加入CoCl2使其濃度分別為100、50、0 μmol/L。3 d換液1次，保留其藥物濃度，每天在顯微鏡下觀察，并于7、14 d后用油紅O染色后，加入異丙醇溶液500 μl/孔，震蕩脫色10 min，使細胞內染色甘油三酯充分溶解，酶標儀540 nm處測光吸收值[7]。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠ADSCs的原代培養與形態學觀察

原代ADSCs培養48 h換液后，即可觀察到貼壁細胞，細胞形態短小，呈長梭形(圖1a)。培養至4 d，細胞明顯增多、變大，長梭形、紡錘形形態更加明顯(圖1b)。在傳代培養中，細胞基本保持長梭形的形態(圖1c)。

2.2 ADSCs分化能力鑒定

成骨誘導7 d后，油紅O染色可見細胞內有鮮紅色透亮脂滴形成(圖2a)。成骨誘導后茜素紅染色均陽性，表明誘導后脂肪干細胞外基質中有鈣結節形成(圖2b)。

2.3 大鼠ADSCs的流式細胞儀鑒定

流式細胞儀檢測發現，ADSCs陽性表達間充質細胞表面標志CD29、CD44，陽性率均為90%以上，低表達造血干細胞表面標志CD34、CD45(圖2c)，表明取得的ADSCs純度較高。

2.4 不同濃度的CoCl2對ADSCs增殖的影響

MTT檢測發現，加入200、400 μmol/L的CoCl2相比空白對照組，ADSCs的增殖能力受很大抑制(P<0.05)；而100 μmol/L和50 μmol/L組ADSCs的增殖能力并未產生明顯影響(P>0.05，圖3)。

2.5 不同濃度的CoCl2對ADSCs的HIF-1α表達的影響

Western blot檢測結果顯示，HIF-1α蛋白在50 μmol/L和100 μmol/L組中的細胞均有表達，且均高于對照組的表達量(圖4)。

2.6 不同濃度的CoCl2培養液對ADSCs成脂的影響

觀察各組細胞在倒置顯微鏡下的形態發現，相比對照組，CoCl2組呈較多脂滴(圖5)。在對照組中，通過油紅O染色后定量測量發現，相比對照組，加入CoCl2組中的ADSCs的成脂肪趨勢更加明顯(P<0.001，表1)。

圖1 ADSCs的形態 a. 原代ADSC培養2 d后(×200) b. P1代ADSCs 培養4 d后(×100) c. P3代ADSCs培養4 d后(×100)圖2 脂肪干細胞的分化能力 a. ADSCs成脂誘導7 d后油紅O染色 (×400) b. ADSCs成骨誘導28 d后茜素紅染色(×200)圖3 MTT實驗檢測處于不同濃度的CoCl2后，不同時間ADSCs增殖能力的變化圖4 Western blotting檢測各組標本中HIF-1α的表達圖5 培養14 d后，觀察光鏡下各組油紅O染色結果 a.對照組(×200) b.50 μmol/L組(×200)c.100 μmol/L組(×200)

Fig1 ADSCs under the inverted microscope. a. original ADSCs at 2 days after culture (×200). b. P1 ADSCs at 4 days after culture (×100). c. P3 ADSCs at 4 days after culture (×100).Fig2 ADSCs differentiation a. ADSCs of adipogenic differentiation at 7 days by Oil red staining (×400). b. ADSCs of osteogenic differentiation at 7 days by Alizarin red staining (×200) .Fig3 The proliferation activity levels of ADSCs at different CoCl2concentration in each group.Fig4 The protein levels of HIF-1α in each groups.Fig5 ADSCs at 14 days after culture by Oil red staining in each groups. a. control group(×200). b. 50 μmol/L group(×200).c. 100 μmol/L group(×200).

表1 不同濃度的CoCl2對ADSCs的成脂分化的影響Tab1 Effect of CoCl2 at different concentrations on ADSCs adipogenic differentiation n=5

注：*主效應的F統計量和P值；#交互效應的F統計量和P值

3 討論

脂肪干細胞因具有易獲得性及不涉及倫理問題等優點而成為理想的種子細胞來源[8-9]。在臨床中已有實驗證實，將脂肪干細胞混入需要移植的脂肪細胞后，能較單一的脂肪細胞注射達到更好療效[10]。從而提示我們需要探求脂肪干細胞在這樣一個相對缺氧環境中，它的增殖是否受到影響以及在這種情況下轉歸如何。

目前，國內外一些研究表明，將用于治療的間充質干細胞事先經過一定程度的預缺氧，可以得到更好的治療效果，并提出這可能是由于細胞內的HIF-1的調節[11-13]。HIF-1分為HIF-1α和HIF-1β的形式存在，其中HIF-1α屬于功能性亞基，HIF-1β屬于結構性亞基，HIF-1α亞基的表達活性決定了HIF-1的生理活性，因此，HIF-1α在調控組織中氧代謝的適應反應中起重要作用。目前，已經明確的受缺氧誘導因子1調控的靶基因有100多個[2,14]。研究表明，這些靶基因影響著干細胞的增殖、分化、遷移等[15-18]。本研究發現，ADSCs在50 μmol/L和100 μmol/L的CoCl2的缺氧環境下，HIF-1α蛋白的表達均高于不缺氧組，即在該濃度的缺氧環境下，可以誘導HIF-1α蛋白的表達。

CoCl2是一種成熟的缺氧模型介導試劑，已被廣泛應用在體外和體內激活HiF-α[3-6]。所以，有必要探求脂肪干細胞在增殖及轉歸過程中是否受到CoCl2濃度的影響，于是我們通過讓ADSCs處于含有梯度CoCl2濃度的培養環境，采用MTT檢測他們的增殖率。我們可以發現，脂肪干細胞只有在處于200、400 μmol/L這樣的培養環境，才會出現增值減弱和死亡的現象。低濃度CoCl2的培養環境并不會對ADSCs的增值產生影響。而且，通過Western blotting我們證明了CoCl2能使HIF-1α的表達隨著其濃度的升高而上升。ADSCs具有穩定擴增的特性，在正常體外環境培養時，并不會表現出特定的分化傾向。我們的研究表明，ADSCs在CoCl2環境下培養時，隨著濃度的提高，脂肪干細胞的成脂傾向越發明顯。我們使用了經過MTT試驗得出的對ADSCs增殖沒有影響的0、50、100 μmol/L這3個組，在沒有加入成脂誘導劑量的情況下，在50 μmol/L組中我們可以觀察到脂肪干細胞發生了明顯的自體成脂傾向，而對照組中則沒有改變，同時隨著CoCl2的濃度的上升，100 μmol/L脂肪干細胞的成脂趨勢會顯得更快更加明顯。這提示我們在進行含有脂肪干細胞的脂肪移植術中，移植的脂肪干細胞由于處于一定的缺氧環境，脂肪干細胞可能會具有一種成脂分化的趨勢，并且它的增殖并沒有受到影響。這也可能是由于缺氧誘導因子HiF-α調控靶基的結果,從而使脂肪干細胞能夠快速增殖并分化為成熟的脂肪細胞，并使術后效果較單一的脂肪移植術好。因此，在進行含有脂肪干細胞的脂肪移植術時，事先將脂肪干細胞進行一定的預缺氧處理可能會取得更好的臨床療效。

本實驗通過體外實驗比較了不同濃度的CoCl2對ADCSs增殖及分化的影響，由此顯示，適當的CoCl2培養環境會刺激脂肪干細胞的成脂分化能力并且不影響其增殖。但是，究竟通過哪些信號通路并且通過什么樣的方式調整還有待于進一步地研究。

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Effectofcobaltchloridepreprocessingontheproliferationandadipogenicdifferentiationofratadipose-derivedstemcells

HUANGJia-cheng,LIUDa-lie,HUANGZi-long,etal.
(DepartmentofPlasticandCosmeticSurgery,ZhuJiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510282,China)

ObjectiveTo observe the effect of cobalt chloride(Cocl2) preprocessing on the proliferation and adipogenic differentiation of rat adipose-derived stem cells(ADSCs).MethodsRat ADSCs were isolated from adipose tissue obtained from rat and were cultured, ADSCs at Passage 3 were cultured in adipogenic, osteogenetic differentiation medium and underwent identification, flow cytometric analysis for cell surface antigen CD29, CD34, CD44 and CD45 were performed. To confirm the effect of cobalt chloride preprocessing on adipogenic differentiation of ADSCs, CoCl2, a HIF stabilizer was used to mimic the hypoxic condition. The expression of HIF-1α were observed by Western blotting. Growth condition of the cells was observed by inverted microscope. MTT method was used to observe cell proliferation activity at different concentrations after hypoxic culture. The effects of hypoxic condition to ADSCs adipogenic differentiation was detected by Oil Red O quantitative assay.ResultsMost ADSCs at Passage 3 were spindle-shaped under the inverted microscope. Flow cytometric analysis showed CD29 and CD44 were positive; CD 34 and CD45 were negative. ADSCs were induced in vitro to osteoblasts and lipoblasts. MTT method revealed the Optical Density value of 100 and 50 μmol/L-1CoCl2and control group were no significant differences between each groups (P>0.05). HIF-1 alpha protein was increased with the CoCl2concentration increasing. At 7th and 14th days after hypoxia culture, Oil Red O quantitative assay showed hypoxia had a significant impact on ADSCs adipogenic capacity (P<0.001).ConclusionCobalt chloride preprocessing condition will enhance the adipogenic differentiation ability of ADSCs and proliferation activity will not be affected.

ADSCs; Cobalt chloride; Adipogenic differentiation

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.04.016

R332

A

1673-7040(2014)04-0235-05

2013-11-18)

國家自然科學基金資助項目(81171831)

510282 廣東 廣州,南方醫科大學珠江醫院 整形美容外科

黃佳誠(1987-),男,江蘇泰州人,碩士研究生.

柳大烈，510282，南方醫科大學珠江醫院 整形美容外科，電子信箱：liudalie@hotmail.com