應用改良擴張器構建大鼠皮膚軟組織擴張模型

楊登峰， 馬 靜， 蘇映軍， 宋雅娟， 余 州， 雷 蕾， 馬顯杰

實驗研究

應用改良擴張器構建大鼠皮膚軟組織擴張模型

楊登峰， 馬 靜， 蘇映軍， 宋雅娟， 余 州， 雷 蕾， 馬顯杰

目的應用改良設計的短注射導管枕形擴張器構建大鼠皮膚軟組織擴張模型，并探討其產生的擴張應力對大鼠皮膚細胞增殖分化的影響，驗證擴張模型的擴張效果，為研究擴張皮膚新生機制提供一個穩定的動物模型。方法SD大鼠隨機分為A、B兩組(每組各30只)，A組大鼠采用改良設計的擴張器，B組大鼠采用上海威寧公司生產的普通擴張器；選擇SD大鼠近頸部切口，以注射壺外置的方式埋置擴張器，制作皮膚軟組織擴張模型。分別采集A組在不同擴張時間點(1、2、3、4、5周)的擴張中心區域皮膚和正常皮膚組織作為標本；利用HE染色方法觀察擴張后皮膚結構的變化；根據增殖細胞表達增殖細胞核抗原，采用免疫組織化學染色方法觀察擴張皮膚中細胞增殖的情況。結果A組應用自行改良設計的擴張器，選擇大鼠近頸部切口構建的皮膚軟組織擴張模型，術后外置的注射壺不易被大鼠咬掉，且術后注水及護理更簡單，模型穩定性顯著高于B組。HE染色結果表明，擴張后皮膚的表皮層明顯增厚，真皮層變??；免疫組織化學染色結果顯示，增殖細胞呈點狀分布，主要集中于表皮基底層和毛囊鞘。結論自行改良設計的短注射導管枕形擴張器，是構建大鼠皮膚軟組織擴張模型的良好實驗材料；擴張應力對大鼠的皮膚結構和增殖產生了影響。

皮膚軟組織擴張術； 動物模型； 擴張器； 皮膚增殖

皮膚軟組織擴張術早已成為整形外科領域最為常用的治療手段之一，因其具有良好的修復效果，深受醫師和患者的歡迎[1]，但也存在治療周期較長的缺點。如何在盡量短的時間內擴張出面積大、質量好的新增皮膚成為研究努力的方向[2]。要想通過干預措施，提高擴張效率，就得通過實驗研究來闡明擴張皮膚組織增生的機制，首先需要建立一個良好穩定的皮膚軟組織擴張動物模型。自2012年12月至2013年4月，我們采用一種自行改良設計的短注射導管枕形擴張器，使其更適合構建鼠的皮膚軟組織擴張模型，并通過HE染色進行組織學觀察、增殖細胞核抗原(PCNA)免疫組織化學染色，觀察擴張應力對皮膚細胞增殖的影響，驗證其擴張效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、實驗動物及擴張模型的制備、分組與標本采集

1.1.1 實驗材料與實驗動物 自行改良設計的短注射導管枕形擴張器(20 ml)，注射導管長約1.5 cm(陜西咸陽硅橡膠制品廠制作；專利號：ZL201320034912.1)，見圖1；普通圓形擴張器，注射導管長約6 cm(上海威寧整形制品有限公司)，見圖2。7周齡SD大鼠60只(由第四軍醫大學實驗動物中心提供)。

1.1.2 擴張模型的制備、分組與標本采集 ①手術方法： 2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，碘伏消毒背部皮膚，以脊柱為中線，在背部皮膚表面用亞甲藍標記擬埋置擴張器的邊界，在近頸部垂直于脊柱線橫行切開全層皮膚，切口長約1.5 cm；用剝離剪在深筋膜淺層鈍性分離預擴張的區域，剝離范圍不超過標記線，形成組織腔隙，鹽水濕紗布填塞止血；分別置入自行改良設計的短注射導管枕形擴張器或威寧公司生產的普通擴張器，注射壺外置，全層縫合切口，最后將注射壺再次單獨打結固定于頸部皮膚。術后動物單籠喂養，無須限制其活動，見圖3。②實驗動物分組與標本采集：A組埋置自行改良設計的短注射導管枕形擴張器，B組埋置上海威寧公司生產的普通擴張器，各30只。分別于手術后第1天開始注水，注水1 ml/d，直至注滿20 ml。A組分別于術后第1、2、3、4、5周在擴張區域皮膚中心部位切取1.0 cm×1.0 cm的皮膚組織，并切取正常未擴張的皮膚組織做對照，標本置于10%福爾馬林溶液中固定，常規石蠟包埋與切片，切片厚度4 μm。

1.2 觀察指標

1.2.1 擴張模型穩定性的比較 統計A、B兩組擴張器在整個擴張過程中發生注射壺被鼠咬掉的個數，計算模型構建成功的百分率，比較兩組模型構建的穩定性。

圖1 自行改良設計的擴張器圖2 上海威寧公司生產的普通擴張器圖3 擴張動物模型 a.脫毛前 b.脫毛后

Fig1 Improved expander.Fig2 Ordinary expander (Shanghai Winner company).Fig3 Animal model of skin and soft tissue expansion. a. before depilation. b. after depilation.

1.2.2 組織學觀察 取A組各擴張時間點和正常皮膚組織石蠟切片，進行常規的脫蠟和水化，HE染色，在光學顯微鏡下觀察，比較各擴張時間點皮膚組織和正常皮膚組織的外形、表皮和真皮厚度、表皮層細胞數目、排列層次、分布特征及真皮層膠原纖維排列的變化規律。

1.2.3 免疫組織化學染色 取A組各擴張時間點和正常皮膚組織石蠟切片，根據增殖細胞表達增殖細胞核抗原(PCNA)，免疫組織化學染色(SP法)：以兔抗大鼠PCNA IgG單克隆抗體(美國ABCAM公司，工作濃度為1∶1000)為一抗，即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒(兔，福州邁新)，DAB顯色試劑盒(×20，福州邁新)進行免疫組織化學染色，并以PBS代替一抗作為陰性對照。以細胞核呈棕黃色著色為陽性細胞，觀察A組各擴張時間點皮膚組織中陽性細胞的分布，雙盲法在200倍光學顯微鏡下，每張切片隨機選取10個視野，采用Image Pro Plus(IPP)6.0圖像分析軟件進行免疫組織化學定量分析，計算其中染色為陽性的細胞個數，取其平均值，比較各個擴張時間點與正常皮膚組織中陽性細胞數目的差異。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 擴張模型穩定性的比較

A組中構建的30只擴張動物模型在擴張的5周內，無一例發生注射壺被鼠咬掉，并且短注射導管能夠限制擴張囊的位置，使其不會因為鼠的劇烈運動而在皮下游走，擴張的皮膚區域更為恒定，模型構建的成功率為100%。B組中構建的30只擴張動物模型，即使將長導管埋在皮下，由于鼠的活動性特別大，在術后前3 d，埋在皮下的長導管很容易延伸到切口外面而被鼠咬斷。在擴張的第1周，有11只擴張器的注射壺被鼠咬掉，后4周有3只注射壺被鼠咬掉。由于注射導管長，有4只擴張囊因鼠的劇烈活動在皮下游走移位，模型構建的成功率只有40%。A組模型構建的穩定性明顯高于B組。

2.2 HE染色結果

未擴張的正常皮膚組織表皮層比較平整，表皮釘突短而尖，極性過度明顯。真皮層膠原纖維束大小均勻、排列整齊，未見到炎癥細胞浸潤(圖4)。擴張后的皮膚組織表皮層明顯增厚，表皮皺褶明顯、凹凸顯著，表皮釘突變得長而鈍并深入真皮層內，形成島狀結構；細胞胞體變大，縱軸變長，細胞層次和數目明顯增加，排列較為緊密，基底層的變化最為顯著，極性過度不明顯。真皮層稍微變薄，膠原纖維束明顯變大，排列欠整齊，間距增寬，其間可見到有炎癥細胞浸潤(圖5)。以上這些變化，從擴張后第1周開始出現，擴張后第4周最為顯著。

2.3 免疫組織化學染色結果

擴張皮膚PCNA表達情況：①在正常未擴張皮膚組織中，只在表皮基底層觀察到PCNA陽性表達的增殖細胞，沿表皮基底層散在點狀分布，數目較少，真皮層尚未發現PCNA+細胞(圖6)。②在受到擴張應力刺激的皮膚組織中，PCNA+細胞的數目明顯增多，在表皮基底層和真皮的毛囊鞘周圍均可見到PCNA+細胞，PCNA+細胞呈點狀密集分布于表皮基底層，呈現復層排列，最高可達2、3層，在棘細胞層和顆粒細胞層也可見到少量點狀分布。在真皮層也可見到環繞毛囊鞘外周呈點狀分布的PCNA+細胞(圖7)。實驗結果表明：擴張后第3周，PCNA+細胞數目達到最高峰，數目高于其他各擴張時間點。擴張后各時間點皮膚組織中，陽性細胞數目顯著高于正常未擴張皮膚組織(P<0.05)，見表1。

3 討論

自從C Radovan (1976年)發明了皮膚軟組織擴張術，該項技術早已在臨床中廣泛應用于整形外科領域的修復重建中，從1985年開始在我國推廣應用已有近30年的歷史。有關皮膚軟組織擴張術的文獻報道數量巨大，但主要集中于臨床應用方面；有關基礎理論研究的文獻相對較少，基礎研究也主要集中在擴張后皮膚局部組織形態與病理、生理的變化，擴張方法改進的研究，皮瓣預構和延遲作用等方面的研究[3]，有關擴張機械應力作用下皮膚組織增生的機制仍不清楚?；A理論的研究必然離不開動物模型的建立，既往我們研究所已有李江、胡亞蘭、王曉燕等[3-5]用家豬為實驗動物構建模型；賀忠文、陳惠平等[6-7]分別用家犬和兔子為實驗動物構建模型，但用這些大動物構建模型存在手術麻醉困難、術后護理不便、大批量構建模型成本高等問題，而且能夠用于這些大動物的抗體等分子生物學試劑很有限，使得研究深度受到限制。為了避免使用大動物帶來上述存在的問題和局限因素，劉洋、李翅翅等[8-10]用鼠為實驗動物構建模型。但劉洋等并未詳細介紹模型的構建方法；李翅翅等使用的是上海威寧公司生產的10 ml擴張器，最初選擇背部近尾處橫行切口[9]，但在手術后的飼養階段發現，由于鼠的活動性大，身體容易屈曲，尾端外置的注射壺很容易被鼠咬掉，導致模型構建的成功率相對較低。因此，李翅翅等改變切口位置，選擇近頸部橫行切口[10]，但由于威寧公司生產的微型擴張器注射導管偏長，即使將長導管埋在皮下，由于鼠的活動性特別大，在術后前3 d傷口未愈合時，埋在皮下的長導管很容易延伸到切口外面而被鼠咬斷；就需要用懸吊等方法限制鼠的自由活動，但這樣就給術后飼養帶來了很大的不便，而且影響鼠的生命質量。為了避免注射壺被鼠咬掉，同時又不限制鼠的自由活動，我們自行改良設計了短注射導管枕形擴張器(20 ml)，選擇近頸部橫行切口，主要有以下優點：①改良設計的擴張器注射導管長度只有1.5 cm，手術時將注射壺打結固定于頸部，沒有多余長度的導管可以從皮下延伸出來，因此注射壺不容易被鼠咬掉；②注射壺固定于頸部不易被鼠咬掉，因此，無需限制鼠的自由活動，可減少對鼠生命質量的影響，而且術后護理、飼養更方便；③注射導管較短可以限制擴張囊在鼠皮下的游走，使皮膚擴張的位置不會因為鼠的活動性大而發生改變；④枕形擴張囊的設計比起圓形擴張囊可以使擴張位置更恒定，也限制了擴張囊因鼠的活動劇烈而游走，并且在切取擴張皮膚作標本時，擴張中心位置更容易標記和選擇。

圖4 正常未擴張皮膚(HE ×100)圖5 擴張后第4周皮膚(HE ×100)圖6 正常未擴張皮膚(PCNA ×200)圖7 擴張后第3周皮膚(PCNA ×200)

Fig4 Unexpanded skin (HE ×100).Fig5 Expanded skin at 4 weeks (HE ×100).Fig6 Unexpanded skin (PCNA ×200).Fig7 Expanded skin at 3 weeks (PCNA ×200).

表1 正常未擴張和擴張后各時間點皮膚組織中PCNA陽性細胞數目

注：與正常未擴張皮膚比較，*P<0.05

目前,公認的擴張后新增皮膚面積的來源有3種：①生物性生長[11-12]；②彈性蠕變；③周圍組織移位。其中，生物性生長是證明皮膚擴張成功的標志。PCNA是反應細胞增殖的良好標志物，實驗通過PCNA免疫組織化學染色，證實了擴張后的大鼠皮膚組織中PCNA的高表達，此外,HE染色的鏡下結構也表明擴張后的皮膚組織表皮層明顯增厚。這些實驗結果與臨床上人體擴張后皮膚組織在形態學上的變化及實驗結論相一致[13]，證明了該擴張模型的擴張效果，能夠產生“額外”的新生皮膚。筆者詳細介紹了采用自行改良設計的短注射導管枕形擴張器構建大鼠皮膚軟組織擴張模型的實驗方法，并通過HE染色結果顯示的組織學變化和PCNA免疫組織化學染色結果顯示的擴張應力對皮膚細胞增殖產生的促進作用，證明了其擴張效果；希望能為其他研究擴張皮膚新生機制的研究者，提供一個良好的擴張器材料和構建動物模型穩定的實驗方法。

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Applicationofimprovedexpanderonconstructratmodelofskinandsofttissueexpansion

YANGDeng-feng,MAJing,SUYing-jun,etal.
(InstituteofPlasticSurgery,XijingHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

ObjectiveThe rat model of skin and soft tissue expansion was constructed to explore the effect of the tensile stress on the skin cell differentiation and further to detect the result of expansion which could offer the stable animal model for the newborn mechanisms of expanded skin.MethodsSD rats were randomly divided into two groups (30 rats in each group). Improved expanders were applied in group A, and ordinary expander which were produced by Shanghai Winner company were applied in group B. Both the expanders were implanted under superficial fascia on the back of SD rats. Samples of normal skin and expanded skin were collected from rats in group A. The structure of skin was observed with HE staining, and the distribution characteristics of PCNA positive cells were observed with immunohistochemistry staining.ResultsStability of the model in group A was significantly higher than that in group B. After the expansion, the epidermis obviously was thickened, and the dermis were thinned. Punctate distribution of proliferating cells was mainly observed in the basal layer of the epidermis and hair follicle sheath with immunohistochemistry staining.ConclusionIn this study, we provided a good expander material and stable experimental methods to construct an animal model of skin and soft tissue expansion.

Skin and soft tissue expansion； Animal model； Expander； Skin proliferation

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.04.018

R332

A

1673-7040(2014)04-0241-04

2013-11-04)

國家自然科學基金資助項目(81171826;81272117);陜西省社發攻關項目(2012SF2-01-2)

710032 陜西 西安，第四軍醫大學西京醫院 全軍整形外科研究所

楊登峰(1984-)，男，安徽阜陽人，碩士研究生.

馬顯杰，710032,第四軍醫大學西京醫院 全軍整形外科研究所,電子信箱: majing@fmmu.edu.cn