基于COⅠ基因的西南大西洋部分經濟魚類DNA條形碼鑒定

張馨月 劉 巖 張秀梅 高天翔

(1. 中國海洋大學水產學院, 青島 266003; 2. 中國水產科學研究院 南海水產研究所, 廣州 510300)

目前, 國際上廣泛使用 FishBase (http://fishbase.org)等魚類分類檢索系統進行魚類形態學鑒定, 但由于部分地區魚類開發和研究水平不一, 因此單一的形態學鑒定無法完全滿足物種鑒定的需求。DNA序列輔助分類作為一個理想的輔助形態學分類手段應運而生, 迄今已有 30多年歷史。2003年, Hebert等[1,2]明確提出了DNA條形碼(DNA barcoding)的概念, 即通過使用短的、標準化的基因片段來進行物種鑒定, 以提高真核生物識別的效率, 同時使得DNA序列輔助分類方法得到一定程度的統一, 加快進程發展。目前, DNA條形碼技術已經成為一個被廣泛接受的物種鑒定工具, 它重點強調了標準化和數據驗證[3], 亦被稱為 DNA分類學[4]。目前, 線粒體細胞色素 C氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因是動物 DNA條形碼研究中使用最為廣泛的標準基因[5], 因為它基本滿足DNA條形碼理想序列的3個基本判斷標準: (1)序列變異水平適宜; (2)變異區域兩端的序列高度保守; (3)序列長度適宜[6]。這一結論在許多魚類[6,7]、昆蟲[8,9]和鳥類[10]等動物中均得到很好驗證。

西南大西洋公海漁場涵蓋巴西北部至阿根廷南部的南美洲東部沿海, 巴西暖流和?？颂m寒流在此交匯產生渦流,為多種海洋漁業資源生物提供產卵場和索餌場。因此, 西南大西洋公海漁場漁業資源豐富, 許多國家、地區的拖網及魷釣船只在此作業。我國在西南大西洋公海漁場拖網作業始于 2008年, 起步較晚, 因此我國對于該海域的相關研究相對較少, 尤其關于該海域常見漁獲種類的研究報道在國內仍屬空白。同時, 拖網作業對于物種的選擇度不高, 所得漁獲物種類十分豐富, 為了更好地認識漁獲物的生態習性和經濟價值, 正確鑒定所得漁獲的種類顯得尤為重要。本文旨在針對西南大西洋公海部分拖網漁獲物進行DNA條形碼研究, 探索其在魚類輔助物種鑒定中的適用性, 以期填補我國對該海域魚類DNA條形碼相關研究的空白, 為我國遠洋拖網漁業發展提供更多的基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與形態學鑒定

本研究樣本來自于山東榮成某漁業集團有限公司的雙拖網生產船在西南大西洋(44.8°—47.0°S, 59.5°—61.0°W)巴塔哥尼亞海域探捕作業生產時隨機采集的漁獲物, 采集時間為2011年1—4月。

參照文獻[11—14]、FishBase(http://fishbase. org/)等進行形態學鑒定, 樣品初步判定為 14個物種, 參考綜合分類學信息系統(Integrated Taxonomic Information System,ITIS) 和《拉漢世界魚類名典》[15]對物種的有效名以及分類地位進行確定(表 1)。對每個樣品拍照記錄, 取背部肌肉組織, 用95%乙醇固定, –20℃保存備用。

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序

取約 100 mg的肌肉組織經蛋白酶 K消化后, 參考《分子克隆實驗指南》的酚/氯仿抽提法[16], 提取基因組DNA, 于–20℃存放。COⅠ基因序列擴增引物為[6]: F1:5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′ F2: 5′-TC GACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3′; R1: 5′-TAGAC TTCTGGGTGGCCA AAGAATCA-3′; R2: 5′-ACTTCAGG GTGACCGAAGAATCAGAA-3′。

將F1與F2等體積混勻標記為引物F, R1與R2等體積混勻標記為引物 R, –20℃保存備用。PCR反應總體積為 25 μL, 其中包含: 超純水 17.25 μL, 10×Buffer 2.5 μL,dNTPs 2 μL, 5 μmol/ L 濃度的引物各 1 μL, Taq聚合酶0.25 μL和DNA模板 1 μL。PCR反應條件為: 95℃預變性2min; 94℃變性0.5min, 52℃退火0.5min和72℃延伸1min,35個循環; 72℃延伸 10min; 最后保持在 4℃[6]。所有的PCR反應均在Biometra熱循環儀上完成。每組PCR反應均設置陰性對照用來檢測是否存在污染。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 目的產物經小量膠回收試劑盒(上海華舜)純化后, 送上海桑尼生物科技有限公司進行雙向測序, 以確保序列的可靠性。

1.3 物種核對與序列分析

利用Dnastar軟件包(DNASTAR.Inc., Madison.USA)進行序列比對、拼接, 并輔以手工調整。利用DNASP[17]軟件計算序列的變異位點數、單倍型數和單倍型多樣性等。用MEGA4.0軟件[18]分析核苷酸組成, 基于Kimura-2-parameter雙參數模型(K2P)計算遺傳距離, 利用鄰接法(Neighbor joining)構建分子系統進化樹, 經1000次重復抽樣(Bootstraps)檢測其置信度。

同時將所測得序列與NCBI (National Center for Biotechnology Information)網站以及BOLD參考條碼庫(Reference Barcode Database)中的同源片段序列進行比對,輔助評估形態學分類的準確性。

2 結果

2.1 形態學鑒定及有效種名的確定

經形態學鑒定, 最終確認的魚類有效種名及其分類地位如表1 所示。71個樣本分屬于2綱6目10科14種。通過綜合比較, 發現文獻[11—14]中相關魚類的物種信息存在一定差異。因此, 樣本的物種鑒定又輔以 FishBase網站, 采用三種資料中一致性良好的物種描述信息進行種類鑒定。并最終參考分類學信息系統(Integrated Taxonomic Information System, ITIS)和《拉漢世界魚類名典》[15]確定所研究樣本的有效種名(圖1)。

2.2 COⅠ基因片段序列分析

所測定的71條序列長度均約為652 bp, 沒有插入和缺失。輻鰭魚綱的58條COⅠ序列的平均堿基組成為T:29.7%、C: 28.1%、A: 23.5%、G: 18.8%, 其中, A+T含量(53.2%)高于G+C含量(46.9%); 軟骨魚綱的13條COI序列的平均堿基組成為T: 31.8%、C: 26.2%、A: 25.2%、G:16.9%, 其中A+T含量(57%)明顯高于G+C含量(43.1%)。同時, 硬骨魚綱的GC含量高于軟骨魚綱鰩類的GC含量,這與Ward等[6]的研究結果相一致。各密碼子的堿基含量結果顯示, 第1密碼子位點GC含量(54.3%)顯著高于第2和第3密碼子位點(44.5%和38.6%), 堿基組成表現出明顯偏倚性。

各分類階元遺傳距離(K2P)如表 2所示, 種內遺傳距離平均為0.0028, 而同屬物種間的遺傳距離為0.0335, 約為種內遺傳距離的12倍, 這與Hebert等[8]提出的“10×規則”相一致。同樣, 科內屬間遺傳距離平均為 0.1866, 同目的科間平均為 0.2361, 同綱內平均為 0.2369以及不同綱間平均值為 0.3184。由此可見, 遺傳距離(K2P)隨著分類階元的提高而增大, 且種以上分類階元隨著其等級的升高, 其遺傳距離(K2P)的增長明顯減緩。

2.3 DNA條形碼序列比對

將本研究獲得的COⅠ基因序列與GenBank數據庫進行序列比對分析, 結果顯示, 除眼點平 鲉(Sebastes oculatus)外, 所有物種均具有一致性大于98%的同源DNA條形碼序列, 其中 13個魚種形態學鑒定結果與一致性最高的比對結果相對應。數據庫中與形態鑒定為眼點平鲉(Sebastes oculatus)一致性最高的序列為南太平洋密星平鲉(Sebastes constellatus)(100%), 但后者形態特征與分布情況同該魚種差距甚大, 因此將該樣本確定為比對結果中一致性為99% 的眼點平 鲉。

將所有序列再導入BOLD系統v3中進行檢索, 以進一步核實物種的分類地位以及有效的物種名。BOLD中檢索結果與 NCBI網站比對結果基本一致。但鞍斑杜父鱸?(Cottoperca gobio)在 BOLD系統中比對結果為似杜父鱸?(Cottoperca trigloides)(99%), 二者均為牛魚科杜父鱸 ?屬(Cottoperca), 似杜父鱸 ?(Cottoperca trigloides)在綜合分類學信息系統(Integrated Taxonomic Information System, ITIS)和《拉漢世界魚類名典》中均無記錄, 且FishBase等數據庫中也僅對其分布區域有所描述, 為南極洲海域底棲性魚類, 其形態學描述和圖片處于缺少狀態。由于 FishBase 所描述的物種似杜父鱸 ?(Cottoperca trigloides)分布區域與本實驗樣品采集地點不一致, 故此魚種種名最終根據形態鑒定和 GenBank比對的結果確定為鞍斑杜父鱸(Cottoperca gobio)。

2.4 分子系統學分析

表2 各分類階元遺傳距離(K2P)統計表Tab. 2 Summary of genetic divergences (K2P) within various taxonomic levels

本文涉及14個物種的71條COⅠ序列共有28個單倍型, 基于28個單倍型構建系統樹(圖2)。由圖可以看出,各物種的個體均各自聚為獨立的一支, 且不同物種界限清晰。各分類階元內的聚類結果基本與形態學分類相一致。例如: 鰩科(Rajidae)的長吻鰩屬(Dipturus)魚類先聚為一支, 然后與鰩科的其他屬聚為一支; 無須鱈科(Merlucciidae)的無須鱈屬(Merluccius)和尖尾無須鱈屬(Macruronus)也聚為獨立的一支; 鲉形目(Scorpaeniformes)的兩種魚獨立聚為一支; 鱸形目(Perciformes )的鞍斑杜父鱸 ?與拉氏南美南極魚也獨立聚為一支。但目內屬間的聚類出現一些異常, 鱸形目(Perciformes )烏魴、腹翼鯖分別與其他目的魚類先聚在一起。

3 討論

本文運用COⅠ基因DNA序列標記對我國西南大西洋遠洋漁業的部分漁獲魚種的形態學鑒定結果進行進一步探討與分析。資料收集階段發現我國目前僅針對本國近海海域進行魚類學相關研究, 但有關其他外海海域的魚類學相關資料極度匱乏, 魚類形態學分類系統亟待補充與修訂。因此, 本研究中形態學鑒定主要依據文獻[11—14]等國外研究報道。但由于不同材料編纂角度有所區別,導致部分內容出現分歧, 為避免形態學分類結果的不確定性, 本文從分子輔助分類的角度進行一定程度的修正,保證了物種鑒定的準確性。

圖2 基于14個物種的COⅠ序列單倍型構建的鄰接關系樹Fig. 2 The neighbor-joining tree of 14 species resulted from haplotypes of CO Ⅰsequences

3.1 COⅠ條形碼鑒定存在的問題

自Hebert等[1]提出以COⅠ基因作為DNA條形碼以來,該基因在不同生物類群中應用的有效性得到了越來越多的驗證[6—10,19], 由此可見COⅠ基因在動物條形碼應用中具有一定的優勢。其中COⅠ通用引物[6]的廣泛適用性在本研究中得到良好證明。本研究采用的通用引物對輻鰭魚綱10種及軟骨魚綱鰩科4種進行擴增, 均順利獲得相應的序列(表1), 表明該通用引物在魚類物種中具有較普遍的適用性。

然而, COⅠ條形碼在鑒定物種過程中仍存在一定局限性。在確定物種的有效種名時, ITIS分類系統與FishBase網站中關于編號Y3的記載出現分歧。根據樣本COⅠ序列與NCBI網站和BOLD系統的比對結果, 此物種的拉丁文名為Dipturus chilensis, 而FishBase網站中認為此種與Zearaja chilensis為同種異名。比較發現, Dipturus chilensis屬于長吻鰩屬(Dipturus), 而Zearaja chilensis為殼鰩屬(Zearaja)物種。為確定準確的種名, 本研究根據種間遺傳距離進行分析, Y3與本研究中阿根廷長吻鰩間的遺傳距離僅為0.0335, 且在N-J系統樹中, 兩者首先聚為一支, 因此判斷Y3為長吻鰩屬的一種。故選擇Dipturus chilensis為其有效種名。分析產生此類同種異名情況的原因: (1)缺乏足夠的樣本資料, 導致形態學鑒定出現偏差,命名錯誤; (2)外形相似且物種間遺傳分化水平不高,COⅠ條形碼序列難于分辨[20]; (3)研究時間久遠, 鑒定方法不夠完善, 且后期研究結果未及時更新至數據庫。

3.2 COⅠ條形碼序列在系統進化分析中的適用性

根據本研究COⅠ條形碼序列得到屬內種間的遺傳距離為0.0335, 約為種內遺傳距離(0.0028)的12倍, 這滿足了 Hebert等提出的“10×規則”, 即利用 COⅠ序列進行有效物種鑒定的關鍵是種間遺傳距離必須大于種內遺傳距離, 且距離差異大于10倍[8], 這也表明了COⅠ條形碼序列適用于物種鑒定的內在特征。同時, 通過本研究所得NJ系統進化樹(圖2)分析得出, COⅠ條形碼序列不但可以進行物種水平分類鑒定, 還可以用來進行一定程度的系統進化分析。但是, 由于COⅠ序列長度僅為650 bp左右,信息位點數目有限, 且科間變異較大, 堿基的轉換顛換比趨于飽和, 因此對于深入的系統進化分析來講其參考價值不高。正如本文結果所示, 基于 COⅠ基因所建 NJ樹僅對屬內階元具有較為準確的辨識力, 而對于其他高級階元的準確性明顯降低, 這與隨著其分類階元的升高,種間遺傳距離(K2P)的增值明顯減緩的趨勢相一致。

4 結論

研究認為, 在形態學分類資料缺乏的情況下, COⅠ基因序列可以作為魚種鑒定的一種便捷有效的方式, 同時可以用來對魚類形態學分類系統進行補充和修訂。但是,COⅠ條形碼序列對種以上階元的物種鑒定存在其局限性。由于COⅠ基因的突變速率相對線粒體DNA控制區的要慢些[21], 因此若針對分化程度低的物種,選擇 Cytb或控制區可能更為有效。目前, 由于 COⅠ序列數據仍然有所欠缺, 本研究的拖網漁獲物中仍有一些物種未能進行序列比對鑒定。因此, 為了更好地發揮 COⅠ基因序列在物種鑒定中的橋梁作用, COⅠ條形碼數據庫亟需完善,以求達到高質量高庫容要求。與此同時, 為突破 COⅠ條形碼序列的一些固有限制, 一方面要加強標本的形態學數據以及標準圖片的收集和整理, 另一方面應及時補充低分化物種的其他相關數據(如線粒體DNA控制區等)進行更進一步的分析。