響應面法優化微波輔助提取苦瓜多糖工藝的研究

陳洋洋，李盈蕾，周燕紅*

(1.湖北科技學院藥學院，湖北咸寧437100;2.淮海工學院化學工程學院)

目前的研究報道，已經從苦瓜中分離出的化學成分有糖類、皂苷類、生物堿類、蛋白質類、脂類、甾類、萜類、微量元素等多種成分［1］?？喙隙嗵鞘强喙现泻枯^高的天然生物活性物質之一，幾乎無毒副作用，在治療腫瘤、抗衰老、病毒性疾病等方面療效獨特［2］。因此，探索苦瓜多糖最佳提取條件在化工、醫療方面意義重大。

微波輔助萃取技術是一種新型的萃取技術，是利用一種波長極短、頻率很高的輻射能來加熱物料達到萃取目的的方法，已經用于多項中草藥的浸提生產線之中。為優化苦瓜多糖的微波輔助提取工藝，利用SAS軟件和響應面分析相結合的方法，研究各自變量及其交互作用對多糖提取率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 材料:苦瓜(市購)、濃硫酸(95.5%)、分析純葡萄糖、苯酚(80%)、乙醇(85%)等均為國產分析純。儀器:超聲微波組合反應系統、紫外-可見分光光度儀、循環水真空泵、電熱恒溫水浴鍋、電子天平、旋轉蒸發儀、高速冷凍離心機。

1.2 方法

1.2.1 實驗步驟 ①苦瓜多糖的提取、分離工藝:鮮苦瓜→去籽→切片→干燥→粉碎→水浸提→過濾→澄清液→濃縮液→醇沉→洗滌→干燥→苦瓜粗多糖。②苦瓜多糖的定量測定方法:苦瓜多糖的含量測定采用苯酚-硫酸法。但苦瓜多糖是一種由半乳糖、甘露糖等組成的雜多糖，且多糖中各種單糖的組成與品種也有關系，所以單純用葡糖糖作標準計算苦瓜多糖的含量必然會存在一定的偏差。參考董群等［3］的研究成果，確定苦瓜多糖對葡萄糖的校正系數，以減小實驗誤差。

1.2.2 苦瓜多糖提取率的計算方法 苦瓜多糖提取液與苯酚-硫酸反應后，用紫外可見分光光度計測定提取液的吸光度，再由葡萄糖標準曲線，結合校正系數，計算多糖的含量，并計算提取率。提取率:式中 n-稀釋倍數c-多糖濃度，mg/ml;v-提取液體積 ml;M-苦瓜干重 g。

1.3 葡萄糖標準曲線的繪制

1.3.1 葡萄糖最大吸收波長的選擇 準確配制并稱量50 mg/L的葡萄糖溶液，用苯酚-硫酸顯色，以蒸餾水為參比，在400～650 nm之間每隔10 nm測一次吸光度，在最大吸收波長附近，每隔5 nm測定一次吸光度。由實驗結果，選葡萄糖最大吸收波長為490 nm。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的繪制 準確稱取葡萄糖標準品0.2003g(提前105℃干燥箱至恒重)，置于容量瓶中(200 ml)，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，配成1.0mg/ml的標準溶液，再分別移取0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 ml標準溶液，置于 100 ml容量瓶中稀釋至刻度，搖勻，配成系列葡萄糖標準溶液。準確稱取0.33g苯酚，加入100 ml濃硫酸，置于棕色瓶中，混合搖勻后置于冰箱中。再分別準確移取1 ml系列的標準溶液至具塞試管中，以1 ml蒸餾水作空白，每試管再加入4 ml苯酚-硫酸試液，立即搖勻，置于冰水浴中，然后一起置于沸水浴中加熱7min，之后用流動自來水迅速冷至室溫，放置10min后，于490 nm處測定其吸光度，繪制標準曲線，并計算其標準曲線回歸方程。葡萄糖濃度在0～20 mg/L之間時，吸光度與濃度呈良好的線性關系，線性相關系數R2在0.998以上。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對提取率的影響 取4份10 g樣品，分別加入 100 ml、150 ml、200 ml、250 ml的蒸餾水，在500W功率下分別提取20min，過濾、濃縮至30 ml，加入2倍體積(60 ml的95%的乙醇)醇沉24 h。離心(20℃，8000R/min，10min)，去除上清液溶解并定容至100 ml，取0.5 ml加入1 ml苯酚(5%)和4 ml濃硫酸在60℃水浴條件下加熱30 min，測吸光度A值，由標準曲線分別計算提取率。

由圖1可知，料液比從1∶15提高到1∶20時，苦瓜多糖含量急劇上升，但隨著料液比的繼續提高，苦瓜多糖含量則出現下降的趨勢。綜合考慮溶液的效價比和成本工業浸提，宜選用1∶15～1∶20之間的浸提液。

圖1 料液比對提取率的影響

2.1.2 微波萃取功率對提取率的影響 在4份10 g樣品中，加入200 ml蒸餾水，微波萃取功率分別為 300、400、500、600 W，抽濾，濃縮、醇沉、離心、溶解、定容，吸取0.2 ml加入苯酚和硫酸測吸光度A值，得提取率。

圖2 微波萃取功率對提取率的影響

由圖2可知，當微波輔助萃取的功率從300W提高到400W時，苦瓜多糖含量急劇上升，隨著微波功率的繼續提高，開始大幅下降。因此，微波輔助的功率選擇為400～500W之間。

2.1.3 提取時間對提取率的影響 在4份10 g樣品中，按1∶20加入200 ml蒸餾水，溫度設定為50℃，在400W功率條件下分別提取10、15、20、30min。過濾、濃縮至30 ml，加入2倍體積(即60 ml的 95%的乙醇)醇沉 24 h。離心(20℃，8000R/min，10min)，去除上清液溶解并定容至100 ml，取 0.5 ml加入 1 ml苯酚(5%)和 4 ml濃硫酸在60℃水浴條件下加熱30 min，測吸光度A值，由標準曲線分別計算提取率，見圖3。

圖3 提取時間對提取率的影響

從圖3可以看出，提取率隨著提取時間先升高然后下降。在15 min以內，苦瓜多糖的提取率穩步上升，隨后上升比較緩慢，到20min時，基本達到飽和狀態，進一步延長浸提時間，提取率略有下降，可能是由于長時間高溫提取，導致部分多糖分解所致，故提取時間選擇在10～20 min為宜。

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2.1.4 不同溫度對苦瓜多糖提取的影響 取5份10 g樣品，加入200 ml蒸餾水，用微波輔助萃取法萃取，功率為400 W，分別于反應溫度為30、40、50、60、70 ℃的環境中提取時間為 20 min。抽濾，濃縮、醇沉、離心、溶解、定容，分別提取0.2 ml測吸光度A值，分別計算提取率。見圖4。

圖4 溫度對提取率的影響

圖4顯示出:50℃時是提取的最佳溫度，50℃提取的含量遠遠高于在30℃的提取量，但隨著溫度的繼續增高，多糖的量出現緩慢減少的趨勢，而且溫度越高對苦瓜多糖的生物活性也有不利的影響。這一結果與吳笳笛［4］的研究結果也基本一致。選擇在50℃的水溫來提取苦瓜多糖是比較適當。

2.2 響應面分析實驗 采用響應曲面設計中的設計模型，以微波功率、提取時間、料液比為自變量，根據前期單因素試驗結果，試驗自變量因素編碼及水平，見表1。自變量的編碼值1、0、-1分別代表高、中、低水平，提取率為響應值，用Y表示。響應面分析試驗(見表2)。以1～12為析因試驗，13～17為中心點試驗。

17個試驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點;零點為區域的中心點，零點試驗重復5次，用以估算試驗誤差。采用SAS的RSREG程序進行回歸分析，結果見表3。

響應面圖形是響應值對各試驗因子X1、X2、X3所構成的三維空間的曲面圖，從圖上可以形象地看出最佳參數及各參數之間的相互作用。模型中如果只有一個因素(或自變量)，響應面是二維空間中的一條曲線;當有二個因素時，響應面是三維空間中的曲面。當特征值均為正值時，響應面分析圖為山谷形曲面，有極小值存在;當特征值為負值時，為山丘曲面，有極大值存在;當特征值有正有負時，為馬鞍形曲面，無極值存在［5］，見圖5。

表1 響應面分析因素與水平

表2 響應面試驗設計及試驗結果

表3 回歸分析結果

圖5 微波功率與提取時間對苦瓜多糖提取率的響應面圖和等高線

在料液比為1∶20時，二者對苦瓜多糖提取率的交互影響效應顯著。微波功率升高有助于苦瓜多糖的提取，表現為曲線較陡，當功率達到一定大小時，多糖提取率反而下降，說明過高過低的功率均不利于提取。提取時間對苦瓜多糖提取率的影響在圖中也表現為曲線較為陡峭，時間過長或過短對多糖的提取造成一定的影響。

圖6 微波功率與料液比對苦瓜多糖提取率的響應面圖和等高線

圖6顯示在提取時間水平為0，即15min時，微波功率與料液比的交互影響效應不是太顯著，多糖提取率的響應值變化較小。

圖7 提取時間與料液比對苦瓜多糖提取率的響應面圖和等高線

各因素經回歸擬合后，得:

圖5～7反映了各因素對響應值的影響，由等值線圖可以看出存在極值的條件應該在圓心處。比較三組圖可知:微波功率(X1)和提取時間(X2)對苦瓜多糖提取率的影響最為顯著，表現為曲線較陡;而料液比(X3)次之，表現為曲線較為平滑，且隨其數值的增加或減少，響應值變化較小。

用回歸方程描述各因素與響應值之間的關系時，其因變量和全體自變量之間線性關系是顯著的。從回歸方程各項方差的檢驗可知，方程的失擬項很小，表明該方程對實驗擬合情況好，實驗誤差小，因此可用該方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。另外，方程一次項、二次項的影響都是顯著的，因此各具體實驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系，這與單因素試驗的結論也吻合。

為確證最佳點的值，對回歸方程取一階偏導數等于零并整理，得:

得:X1=-0.74，X2=-0.13，X3=-0.16。

可得提取最佳條件為:微波功率413.10W、提取時間14.35min、固液之比1∶19.22?？喙隙嗵翘崛÷实睦碚撝悼蛇_4.819%。為檢驗SAS法的可靠性，在此最優提取條件下，進行驗證，實際測得的平均提取率為4.798%，與理論預測值相比，相對誤差在0.4% 左右。故采用SAS法優化得到的浸提條件參數準確可靠，具有實用價值。

2.3 最佳工藝條件重復實驗 取3份10g樣品，加入230ml蒸餾水，在最佳工藝條件下，即微波功率413.10W、料液比例1∶19.22的環境中提取14.35min。分別提取0.2ml測吸光度A值，分別計算提取率，為4.798%，4.789%，4.808%，平均值為4.798%。

3 結論

結果表明:微波輔助提取苦瓜多糖的最佳條件為:微波功率413.10W，提取時間14.35min，料液比為1∶19.22(W∶V)。此條件下，平均提取率達到4.798%，與預測的理論值4.819% 相差甚少，說明采用該法所得到的提取條件參數可靠，3次可重復性良好。

［1］潘國慶.苦瓜的化學成分及藥理作用［J］.青?？萍?，2004，11(6):30

［2］董加寶，李芳.苦瓜多糖的制備及其抗氧化性質研究［J］.湖南科技學院學報，2008，29(8):51

［3］董群，鄭麗伊，方積年.改良的苯酚-硫酸法測定多糖和寡糖含量的研究［J］.中國藥學雜志，1996，9(31):550

［4］吳笳笛.雙酶水解法提取水溶性苦瓜多糖的研究［J］.安徽農業科學，2005，3(1):73

［5］毛婷，董靜，龔麗，等.響應曲面法優化微波輔助萃取橙皮精油的工藝研究［J］.現代食品科技，2011，27(1):84