外源H2O2影響山黧豆初生根蛋白表達研究

蔣景龍++李麗++王崇英

摘要：以山黧豆（Lathyrus sativus L.）幼苗為試驗材料，施加H2O2處理山黧豆初生根，然后檢測初生根中H2O2含量變化，并采用雙向電泳與質譜鑒定技術，對初生根中蛋白質表達的變化進行分析。結果顯示：施加H2O2處理引起了內源H2O2水平的產生與積累；利用雙向電泳技術，共獲得了850～900個蛋白質點，并檢測到70個蛋白質表現出顯著的差異表達，其中43個蛋白發生上調，21個蛋白發生下調，新出現6個蛋白。對15個蛋白點MALDI-TOF-MS/MS質譜鑒定結果表明，呼吸代謝、蛋白折疊、信號轉導及細胞防御等方面的蛋白參與了山黧豆初生根對H2O2的應答反應。這些蛋白的發現將有助于進一步揭示根對氧化脅迫的應答及H2O2作用機制。

關鍵詞：山黧豆；過氧化氫；初生根；雙向電泳；質譜鑒定

中圖分類號： Q945.78文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0020-06

收稿日期：2013-12-02

基金項目：陜西省自然科學基礎研究計劃（編號：2014JQ3113）；陜西理工學院科研基金（博士啟動基金）（編號：SLGQD13-11）。

作者簡介：蔣景龍（1980—），男，山東棗莊人，博士，講師，主要從事信號分子H2O2對植物生長發育及抗逆性影響研究。E- mail：jiangjinglong511@163.com。過氧化氫（H2O2）是生物體內各種生理代謝的副產物，可以通過有氧代謝過程（如線粒體的呼吸、葉綠體的光合作用和過氧化物酶體）不斷產生，也是活性氧（reactive oxygen species，ROS）中最穩定的一種，一直被認為是對細胞產生毒性的代謝物，在過去的10年里引起了極大的關注[1]。當植物遭受各種各樣的環境脅迫（如干旱、缺氧、高溫、低溫等）及生物脅迫（如細菌侵入）時，H2O2含量迅速升高，脅迫較為嚴重時，產生的過量H2O2會對細胞產生毒害作用，如引起細胞膜脂的過氧化、蛋白質及核酸的降解、細胞凋亡甚至死亡[2]。然而，隨著研究的逐漸深入，人們發現H2O2與其他的ROS分子如超氧陰離子（ O-2· ）、過羥基自由基（HO2·）、單線態的氧（1O2）或羥自由基（·OH）不同，H2O2屬于非激發態的ROS，半衰期很長，并且不攜帶電荷[3]，因此在生物體內H2O2可以作為一種穩定的信號分子，在很多信號轉導過程中扮演重要角色，如誘導氣孔關閉，參與根的向地性生長、側根的發育、細胞壁木質化、細胞程序性死亡以及花粉管和柱頭相互作用等[4]，成為了當今細胞與分子生物學研究的熱點。

Joo等的研究表明，H2O2參與了植物根的向地性生長過程，且H2O2可能是生長素調節信號途徑的下游元件[5]。Li等研究發現，H2O2與生長素相互作用能夠誘導黃瓜、綠豆的不定根生長[6-7]。Ishibashi等用H2O2噴施大豆葉片后發現外源H2O2引起了葉片氣孔的快速關閉，防止水分過度蒸發，并誘導了可溶性糖的合成，增強了滲透調節能力，從而提高了大豆的干旱抗性[8]。

近幾年，越來越多的研究者開始選擇通過施加外源H2O2的方法來研究它對植物生長發育的影響。Wan等用外源H2O2處理水培12 d苗齡的水稻6 h，然后分析水稻葉片生理生化反應，并采用蛋白質組學方法研究水稻葉片對H2O2處理引起的蛋白質水平變化，結果發現了144個差異表達的蛋白；對其中129個差異表達蛋白進行質譜鑒定，結果表明細胞防御、氧化還原、信號轉導、蛋白合成與降解、光合、呼吸與糖類和能量代謝方面的蛋白參與了水稻葉片對H2O2的應答[9]。然而，外源H2O2處理水培植物的過程中首先受到氧化脅迫和發生防御變化的應該是根部。因此，本試驗采用雙向電泳和質譜分析相結合的蛋白質組學方法，研究幼苗期山黧豆的初生根在外源H2O2處理過程中蛋白質表達的變化，為揭示H2O2的作用機制及初生根對H2O2的應答反應奠定基礎。

1材料與方法

1.1植物材料

挑選籽粒飽滿、無損壞的山黧豆種子，用自來水沖洗3次，播種至潮濕的蛭石中萌發48 h后，選取長勢良好、初生根長度為2.0～2.5 cm的幼苗作為試驗材料。將清洗干凈的幼苗水平放置在盛有50 mL 20 mmol/L H2O2溶液的培養皿（直徑90 mm）中處理12 h，只加蒸餾水而沒有H2O2的設為對照組。每個培養皿放置10株山黧豆幼苗，每個處理設置3～4個平行組。處理12 h后分別收集H2O2處理組和對照組幼苗的初生根各4份（每份0.5 g），用錫箔紙包好，-80 ℃冰箱保存。

1.2試驗儀器和試劑

1.2.1主要儀器IPGPhor等電聚焦單元，Hoefer SE600垂直電泳單元，MultiTempⅢcooling冷凝單元，Image Scanner高精度掃描儀，LabScan掃描控制和分析前處理軟件，Image Master 2D Platinum Version 5.0雙向凝膠分析軟件（瑞典 Amershanm Pharmacia Biotech公司），4800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer質譜檢測儀器[ABI（Foster City）公司]，Eppendorf 5417C/R臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2.2試劑IPG膠條（pH值4～7，18 cm）、碘乙酰銨、硫脲、考馬斯亮藍R-250、礦物油均購自GE 醫療集團。二硫蘇糖醇（DTT）、過硫酸銨（AP）、3-[（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）購自Sigma公司。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二銨（TEMED）、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉（SDS）、Tris-堿、二氨基苯胺（DAB）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。丙酮、甲醇、乙酸、甘油、乙酸銨均為國產分析純。

1.3試驗方法

1.3.1內源H2O2的組織化學定位及含量檢測山黧豆初生根中的H2O2組織定位與含量的測定分別參照Jiang等的DAB（3，3-diaminobenzidine，二氨基苯胺）組織化學染色法與H2O2測定的雙酶法[10]。

1.3.2蛋白質的提取與定量參照Wu等的TCA-丙酮法[11]提取山黧豆初生根的總蛋白質，然后參照Bradford 法[12]進行蛋白質定量，蛋白質的上樣量為500 μg/凝膠。等點聚焦與第二向SDS-PAGE凝聚電泳操作均參照雙向電泳指導手冊完成。

1.3.3質譜分析與數據檢索用掃描儀Image Scanner掃描圖像，分辨率為500 dpi，掃描的圖像比例為1 ∶1。使用Image Master 2D Platinum Version 5.0雙向凝膠分析軟件進行凝膠圖像分析。根據蛋白點的體積和光密度進行蛋白質的豐度測定，蛋白點體積與對照點體積相差大于1.5倍，被視為顯著性差異。經過比對后，取差異蛋白質點進行MALDI-TOF/TOF-MS/MS蛋白質檢測。質譜檢測詳細步驟為：（1）膠內酶解及Ziptip脫鹽。每個膠粒切碎后放入EP管中，每管加入200～400 μL 100 mmol/L NH4HCO3/30%ACN脫色，凍干后，加入 5 μL 2.5～10 ng/μL 測序級Trypsin （Promega）溶液，37 ℃反應過夜；20 h左右后，吸出酶解液，轉移至新EP管中，向管中加入100 μL 60% ACN/0.1%TFA，超聲15 min，合并前次溶液，凍干；若有鹽，則用Ziptip（millipore）進行脫鹽。（2）質譜分析。樣品與5 mg/mL HCCA基質1 ∶1混合后，用4800串聯飛行時間質譜儀（4800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer）進行質譜分析，激光源為355 nm波長的Nd：YAG 激光器，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動獲取數據的模式采集數據，PMF質量掃描范圍為800～4 000 u，選擇信噪比大于50的母離子進行二級質譜（MS/MS）分析，每個樣品點上選擇8個母離子，二級MS/MS激光激發2 500次，碰撞能量2 kV，CID關閉。（3）數據庫檢索。使用以下數據庫綜合分析搜索：數據庫：NCBI；搜索類型：肽指紋圖譜（MS/MS 離子搜索）；鑒定成功標準：蛋白分值C.I.%大于90分。

1.4數據統計

測定的所有指標都設置3個以上的平行組，以P≤0.05水平作為顯著性差異的標準對測定的參數平均值進行t檢驗。

2結果與分析

2.1外源H2O2的處理導致山黧豆初生根中內源H2O2的積累

由于DAB能夠和H2O2 反應生成紅褐色的物質，因此通過DAB特異染料染色法分析山黧豆初生根組織內的H2O2積累。結果發現，經20 mmol/L H2O2處理后山黧豆初生根中染色程度比對照組（蒸餾水中正常生長）中山黧豆初生根的染色程度深（圖1），表明外源H2O2處理可能導致了山黧豆初生根內源H2O2的積累。為了驗證這一結果，進一步采用雙酶法直接檢測內源H2O2的含量。結果顯示，未經過H2O2處理的山黧豆初生根中內源H2O2的水平為0.55 μmol/L，而經過H2O2處理的初生根中內源H2O2的水平增加至 0.72 μmol/L，表明外源H2O2處理后，內源H2O2含量顯著增高（圖2），這一結果與染色的結果相符合。

2.2H2O2處理后山黧豆初生根的蛋白圖譜分析

通過雙向電泳技術對H2O2處理的山黧豆初生根與對照組的初生根進行全蛋白的提取與分離，獲得了較好重復性與分辨率較高的電泳圖譜（圖3）。經Image Master 2D Platinum Version 5.0軟件分析發現，每張2-DE圖譜分離到的蛋白質

數目為（840±67）個，對照組與處理組的蛋白點匹配率為862%，相互匹配蛋白數為818，在蛋白質的總數上沒有明顯變化（圖3-A、圖3-B）。與對照組相比，70個蛋白質點的表達發生了顯著或極顯著變化，其中上調蛋白43個，占總差異表達蛋白的61. 43%，下調蛋白21個，占30%，新出現蛋白點6個，占8.57%（表1）。這些結果表明，處理后上調的蛋白點比例要高于下調的蛋白點比例。

進一步分析發現，新出現的蛋白質分子量超過116 ku，等電點靠近7且主要集中在電泳圖譜的a區，而大部分上調的蛋白點主要集中在b、d、e區，下調的蛋白點主要集中在c區（圖3-A）。選取差異極顯著（P<0.01）（變化倍率在2倍以上）的15個蛋白點（其豐度變化如圖3-C）進行 MALDI-TOF/MALDI-TOF/TOF 質譜分析鑒定。

2.3蛋白質的質譜鑒定及分析

MALDI-TOF-MS/MS質譜鑒定結果見表2。表2結果顯示，除了53、55、57這3個蛋白點未鑒定成功外，其余的蛋白都被成功鑒定。將蛋白分值C.I.%高于90分的蛋白選擇出來，列于表2中。對上述鑒定的蛋白點進行功能歸類發現，外源H2O2處理后有5類重要蛋白的表達發生了顯著變化。（1）呼吸代謝相關蛋白。1號蛋白鑒定結果為NADH泛醌氧化還原酶亞基（NADH-ubiquinone oxidoreductase subunit），這種蛋白主要定位于線粒體中，為三羧酸循環的電子傳遞鏈傳遞電子。2號蛋白為NADH脫氫酶輔酶Q-Fe-S蛋白1-線粒體類似蛋白（NADH dehydrogenase[ubiquinone]iron-sulfur protein 1，mitochondrial-like），它是NADH泛醌氧化還原酶亞基中的一種特殊形式，也在三羧酸循環過程中發揮重要的作用。4號蛋白為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase），存在于細胞質和線粒體中，在糖異生過程中起催化作用，它能將草酸乙酰轉化成磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。23號蛋白為一種線粒體加工肽酶β亞基類似蛋白（probable mitochondrial-processing peptidase subunit beta-like protein），這種蛋白主要參與了線粒體的呼吸代謝。結果表明，H2O2處理在山黧豆的初生根中誘導了一系列呼吸代謝和糖異生相關的蛋白。（2）蛋白折疊相關蛋白。10、11、66號蛋白點均為熱激蛋白（heat shock protein），這類蛋白參與了蛋白質修飾過程中的蛋白折疊和去折疊，這類蛋白具有多種功能，如參與各種脅迫應答、協助蛋白質的折疊與組裝、參與細胞防御等。（3）信號轉導相關蛋白。經過H2O2處理后，40號蛋白顯著下調，經鑒定這個蛋白為RanBP1（ran-binding protein 1 homolog b-like），這類蛋白是一類胞質Ran結合蛋白，它能夠抑制RCC1從而刺激GTP從Ran蛋白上釋放出來。Ran是一個GTP結合蛋白，它是RNA和蛋白質從核孔復合體中穿過和轉運過程中所必需的，同時，它也控制著DNA的合成與細胞周期的調控，主要作為一種調節蛋白與膜上的受體蛋白結合，調控細胞的信號轉導。（4）細胞防御相關蛋白。51號蛋白為蛋白酶體的α形式（proteasome subunit alpha type），它的功能是主要清除細胞內的一些多余的肽段，參與細胞內蛋白質的降解與回收。44號蛋白為鐵蛋白（ferritin），這是一種在細胞內普遍存在的蛋白，它主要是一種鐵離子的蛋白倉庫，調控著細胞內的鐵離子含量，并參與了一些離子的轉運，去除細胞內多余的鐵離子。（5）貯存蛋白。21號蛋白為豌豆球蛋白（vicilin），它是豌豆種子中的一種貯存蛋白，這一蛋白在處理的過程中明顯地下調，表明有可能外源施加過高濃度的H2O2能夠下調這些貯存蛋白，加速他們的分解，以提供更多的營養或者能量。50號蛋白為區別豆球蛋白和豌豆球蛋白的第3種貯存蛋白，即convicilin蛋白，這種蛋白已經在豌豆中被分離，但是其功能現在還未研究清楚。此外，值得注意的是質譜分析結果表明，這種蛋白主要存在于野豌豆族（如豌豆、山黧豆、兵豆和蠶豆）中。這一蛋白在處理后的初生根中顯著上調，表明可能起重要作用，而具體作用還需進一步研究。

3討論

H2O2扮演雙重角色，一方面作為植物正常代謝中的有毒副產物，另一方面作為在脅迫生理和信號轉導中的調節性分子；但是目前這2種角色在植物中的轉換機制還不清楚，在H2O2脅迫條件下，植物是如何通過調節胞內代謝網絡和抗氧化系統來使植物生存的機制也還不清楚[9]。本研究采用蛋白質組學的方法在蛋白水平比較了H2O2處理及未處理的初生根內蛋白質的表達變化。結果表明，一些與呼吸作用相關的蛋白，如NADH泛醌氧化還原酶亞基（NADH-ubiquinone oxidoreductase subunit）、NADH脫氫酶輔酶Q-Fe-S蛋白1-線粒體類似蛋白（NADH dehydrogenase[ubiquinone]iron-sulfur protein 1，mitochondrial-like）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase）只在處理組中表達，說明外源的H2O2處理導致了一些特異的呼吸代謝作用的出現。NADH泛醌氧化還原酶也稱復合體Ⅰ，是線粒體呼吸電子傳遞鏈上的第一個酶體[13]。這表明H2O2脅迫后為了彌補呼吸代謝消耗掉的能量和碳源，這些與呼吸代謝作用和催化糖異生相關的酶被誘導表達。存在于細胞溶質中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（簡稱PEPC），是C4植物光合作用的關鍵酶，同時也在植物的各種代謝中發揮許多重要的功能，如在細胞伸長生長、氣孔開放、氮同化、根系離子吸收、細胞質pH調節、光合碳同化等方面發揮重要作用[14]。在外源H2O2處理后，初生根中誘導表達的這一蛋白可能與根的離子吸收和根細胞內的pH調節有關。外源H2O2處理也是一種脅迫因子，在正常生長發育時期，影響了植物的正常生長。試驗結果發現，處理后一些增強氧化脅迫抗性的重要蛋白表現出了上調，如熱激蛋白（heat shock protein），它是生物體在高溫、鹽漬、寒冷、干旱、饑餓及重金屬離子等環境脅迫下能夠誘導合成的一類應激蛋白，是一種非特異性高度保守的蛋白[15]。逆境脅迫對細胞造成的直接傷害包括使蛋白質變性而失去正常功能，熱激蛋白作為分子伴侶，在逆境脅迫條件下可以維護蛋白的功能結構、防止非天然蛋白的集聚、重新折疊變性蛋白以恢復其功能結構以及清除有潛在危害的變性蛋白等[16]。Wan等研究表明，用外源H2O2處理水培水稻，然后對葉片的蛋白質組學進行分析，結果發現大量的熱激蛋白上調表達[9]，這一結果和本試驗結果相吻合。但是目前還沒有在植物初生根的蛋白質組學中發現熱激蛋白上調的報道。熱激蛋白的表達增強可能提高了山黧豆初生根對外源H2O2引起的脅迫抵抗，這也許與熱激蛋白表達的增強相關。外源H2O2脅迫有可能引起部分蛋白質降解，因此一些參與細胞內蛋白質的降解與回收的蛋白，如蛋白酶體的α形式（proteasome subunit alpha type）表現出了明顯的上調。還有一些起到氧化還原和信號轉導方面的蛋白也發生了明顯的上調或下調，如鐵蛋白（ferritin）和RanBP1蛋白。鐵蛋白是一種廣泛存在于生命體中的鐵貯藏蛋白，具有調節機體鐵代謝平衡、去除二價鐵毒性和防止機體氧化損傷的雙重功能[17]。植物鐵蛋白也能通過降解途徑加速鐵的釋放，與此功能相呼應的是鐵蛋白在細胞內的表達被鐵離子濃度和氧化應激狀態調控。鐵蛋白的表達在植物中主要受到轉錄水平上的調控，誘導物是鐵離子和氧化物，在動物體內主要受到的則是翻譯水平上的調控，而植物的萌芽和生長均離不開鐵蛋白鐵的釋放[18]。另外，H2O2處理后還有一些種子中貯存的蛋白，如豌豆球蛋白（vicilin）與convicilin蛋白，也發生了重要變化，但是這些蛋白的功能還需要進一步研究。由于質譜分析的蛋白點數目有限，因此更多的信息還需要在以后的研究中進一步挖掘。

3討論

H2O2扮演雙重角色，一方面作為植物正常代謝中的有毒副產物，另一方面作為在脅迫生理和信號轉導中的調節性分子；但是目前這2種角色在植物中的轉換機制還不清楚，在H2O2脅迫條件下，植物是如何通過調節胞內代謝網絡和抗氧化系統來使植物生存的機制也還不清楚[9]。本研究采用蛋白質組學的方法在蛋白水平比較了H2O2處理及未處理的初生根內蛋白質的表達變化。結果表明，一些與呼吸作用相關的蛋白，如NADH泛醌氧化還原酶亞基（NADH-ubiquinone oxidoreductase subunit）、NADH脫氫酶輔酶Q-Fe-S蛋白1-線粒體類似蛋白（NADH dehydrogenase[ubiquinone]iron-sulfur protein 1，mitochondrial-like）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase）只在處理組中表達，說明外源的H2O2處理導致了一些特異的呼吸代謝作用的出現。NADH泛醌氧化還原酶也稱復合體Ⅰ，是線粒體呼吸電子傳遞鏈上的第一個酶體[13]。這表明H2O2脅迫后為了彌補呼吸代謝消耗掉的能量和碳源，這些與呼吸代謝作用和催化糖異生相關的酶被誘導表達。存在于細胞溶質中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（簡稱PEPC），是C4植物光合作用的關鍵酶，同時也在植物的各種代謝中發揮許多重要的功能，如在細胞伸長生長、氣孔開放、氮同化、根系離子吸收、細胞質pH調節、光合碳同化等方面發揮重要作用[14]。在外源H2O2處理后，初生根中誘導表達的這一蛋白可能與根的離子吸收和根細胞內的pH調節有關。外源H2O2處理也是一種脅迫因子，在正常生長發育時期，影響了植物的正常生長。試驗結果發現，處理后一些增強氧化脅迫抗性的重要蛋白表現出了上調，如熱激蛋白（heat shock protein），它是生物體在高溫、鹽漬、寒冷、干旱、饑餓及重金屬離子等環境脅迫下能夠誘導合成的一類應激蛋白，是一種非特異性高度保守的蛋白[15]。逆境脅迫對細胞造成的直接傷害包括使蛋白質變性而失去正常功能，熱激蛋白作為分子伴侶，在逆境脅迫條件下可以維護蛋白的功能結構、防止非天然蛋白的集聚、重新折疊變性蛋白以恢復其功能結構以及清除有潛在危害的變性蛋白等[16]。Wan等研究表明，用外源H2O2處理水培水稻，然后對葉片的蛋白質組學進行分析，結果發現大量的熱激蛋白上調表達[9]，這一結果和本試驗結果相吻合。但是目前還沒有在植物初生根的蛋白質組學中發現熱激蛋白上調的報道。熱激蛋白的表達增強可能提高了山黧豆初生根對外源H2O2引起的脅迫抵抗，這也許與熱激蛋白表達的增強相關。外源H2O2脅迫有可能引起部分蛋白質降解，因此一些參與細胞內蛋白質的降解與回收的蛋白，如蛋白酶體的α形式（proteasome subunit alpha type）表現出了明顯的上調。還有一些起到氧化還原和信號轉導方面的蛋白也發生了明顯的上調或下調，如鐵蛋白（ferritin）和RanBP1蛋白。鐵蛋白是一種廣泛存在于生命體中的鐵貯藏蛋白，具有調節機體鐵代謝平衡、去除二價鐵毒性和防止機體氧化損傷的雙重功能[17]。植物鐵蛋白也能通過降解途徑加速鐵的釋放，與此功能相呼應的是鐵蛋白在細胞內的表達被鐵離子濃度和氧化應激狀態調控。鐵蛋白的表達在植物中主要受到轉錄水平上的調控，誘導物是鐵離子和氧化物，在動物體內主要受到的則是翻譯水平上的調控，而植物的萌芽和生長均離不開鐵蛋白鐵的釋放[18]。另外，H2O2處理后還有一些種子中貯存的蛋白，如豌豆球蛋白（vicilin）與convicilin蛋白，也發生了重要變化，但是這些蛋白的功能還需要進一步研究。由于質譜分析的蛋白點數目有限，因此更多的信息還需要在以后的研究中進一步挖掘。

3討論

H2O2扮演雙重角色，一方面作為植物正常代謝中的有毒副產物，另一方面作為在脅迫生理和信號轉導中的調節性分子；但是目前這2種角色在植物中的轉換機制還不清楚，在H2O2脅迫條件下，植物是如何通過調節胞內代謝網絡和抗氧化系統來使植物生存的機制也還不清楚[9]。本研究采用蛋白質組學的方法在蛋白水平比較了H2O2處理及未處理的初生根內蛋白質的表達變化。結果表明，一些與呼吸作用相關的蛋白，如NADH泛醌氧化還原酶亞基（NADH-ubiquinone oxidoreductase subunit）、NADH脫氫酶輔酶Q-Fe-S蛋白1-線粒體類似蛋白（NADH dehydrogenase[ubiquinone]iron-sulfur protein 1，mitochondrial-like）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase）只在處理組中表達，說明外源的H2O2處理導致了一些特異的呼吸代謝作用的出現。NADH泛醌氧化還原酶也稱復合體Ⅰ，是線粒體呼吸電子傳遞鏈上的第一個酶體[13]。這表明H2O2脅迫后為了彌補呼吸代謝消耗掉的能量和碳源，這些與呼吸代謝作用和催化糖異生相關的酶被誘導表達。存在于細胞溶質中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（簡稱PEPC），是C4植物光合作用的關鍵酶，同時也在植物的各種代謝中發揮許多重要的功能，如在細胞伸長生長、氣孔開放、氮同化、根系離子吸收、細胞質pH調節、光合碳同化等方面發揮重要作用[14]。在外源H2O2處理后，初生根中誘導表達的這一蛋白可能與根的離子吸收和根細胞內的pH調節有關。外源H2O2處理也是一種脅迫因子，在正常生長發育時期，影響了植物的正常生長。試驗結果發現，處理后一些增強氧化脅迫抗性的重要蛋白表現出了上調，如熱激蛋白（heat shock protein），它是生物體在高溫、鹽漬、寒冷、干旱、饑餓及重金屬離子等環境脅迫下能夠誘導合成的一類應激蛋白，是一種非特異性高度保守的蛋白[15]。逆境脅迫對細胞造成的直接傷害包括使蛋白質變性而失去正常功能，熱激蛋白作為分子伴侶，在逆境脅迫條件下可以維護蛋白的功能結構、防止非天然蛋白的集聚、重新折疊變性蛋白以恢復其功能結構以及清除有潛在危害的變性蛋白等[16]。Wan等研究表明，用外源H2O2處理水培水稻，然后對葉片的蛋白質組學進行分析，結果發現大量的熱激蛋白上調表達[9]，這一結果和本試驗結果相吻合。但是目前還沒有在植物初生根的蛋白質組學中發現熱激蛋白上調的報道。熱激蛋白的表達增強可能提高了山黧豆初生根對外源H2O2引起的脅迫抵抗，這也許與熱激蛋白表達的增強相關。外源H2O2脅迫有可能引起部分蛋白質降解，因此一些參與細胞內蛋白質的降解與回收的蛋白，如蛋白酶體的α形式（proteasome subunit alpha type）表現出了明顯的上調。還有一些起到氧化還原和信號轉導方面的蛋白也發生了明顯的上調或下調，如鐵蛋白（ferritin）和RanBP1蛋白。鐵蛋白是一種廣泛存在于生命體中的鐵貯藏蛋白，具有調節機體鐵代謝平衡、去除二價鐵毒性和防止機體氧化損傷的雙重功能[17]。植物鐵蛋白也能通過降解途徑加速鐵的釋放，與此功能相呼應的是鐵蛋白在細胞內的表達被鐵離子濃度和氧化應激狀態調控。鐵蛋白的表達在植物中主要受到轉錄水平上的調控，誘導物是鐵離子和氧化物，在動物體內主要受到的則是翻譯水平上的調控，而植物的萌芽和生長均離不開鐵蛋白鐵的釋放[18]。另外，H2O2處理后還有一些種子中貯存的蛋白，如豌豆球蛋白（vicilin）與convicilin蛋白，也發生了重要變化，但是這些蛋白的功能還需要進一步研究。由于質譜分析的蛋白點數目有限，因此更多的信息還需要在以后的研究中進一步挖掘。