姜黃素對泡沫細胞膽固醇流出及ABCA1表達的影響

周娟

（南華大學醫學院，湖南 衡陽421001）

張大棣

（岳陽市第一人民醫院，湖南 岳陽415900）

蔡恒玲

（南華大學醫學院，湖南 衡陽421001）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）是冠心病發生及嚴重并發癥發生的主要原因。泡沫細胞的形成作為As發生的關鍵環節和典型的病理特征，其貫穿于形成的動脈粥樣斑塊整個過程，直接關系AS的發生發展［1－2］。蓄積于血管內皮下的氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox－LDL）被巨噬細胞或者平滑肌細胞吞噬是形成泡沫細胞的主要階段［3］。膽固醇逆轉運（reverse cholesterol transport，RCT）是外周組織清除過多膽固醇防治脂質蓄積抑制動脈粥樣硬化的核心機制，而斑塊中巨噬細胞膽固醇流出是RCT的重要環節之一，因此促進巨噬細胞膽固醇的流出，可以抑制泡沫細胞的形成，防止斑塊的進展，降低冠心病的發生率［4－5］。ATP 結合盒轉運蛋白 A1（ATP－binding cassette transporter A1，ABCA1）是調節巨噬細胞膽固醇轉運的重要轉運蛋白，其表達的下調會引起細胞膽固醇流出的減少，導致膽固醇酯在細胞蓄積，形成泡沫細胞［6］。因此ABCA1是抑制泡沫細胞形成重要靶標。

姜黃素是從姜黃中提取的一種酚類物質，為姜黃的最要活性成分。近年來大量的研究顯示，姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗凝、降血脂及抑制腫瘤生長等作用［7－8］。而且研究已經證實姜黃素對于大腸癌、乳腺癌、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）和肝病等具有很好的療效［9－10］。此外，最近有研究發現姜黃素可以通過調節過氧化體增殖物激活型受體γ（peroxisome proliferator activated receptorγ，PPAR－γ），抑制RAW264.7巨噬細胞白介素（Interleukin1，IL1）和6（Interleukin1，IL1）及單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein－1，MCP－1）表達調節炎癥反應，并且還可通過調節MAPK通路從而抑制巨噬細胞CD36表達，發揮抗As的作用［11］。然而姜黃素對RCT作用及其機制尚不明清楚。

本實驗以人單核細胞株THP－1源性巨噬細胞為研究的對象，觀察姜黃素對ox－LDL誘導THP1巨噬細胞源性泡沫細胞形成的影響，并對其機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

THP－1人單核細胞購于中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫；總RNA提取試劑盒（TRIzol）購置北京康為世紀生物科技有限公司；氧化低密度脂蛋白（ox－LDL）購于上海滬尚生物科技有限公司；姜黃素、佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）購于美國 Sigma公司；辣根過氧化物酶（horseradishperioxidase，HRP）標記的羊抗兔二抗、羊抗人ABCA1抗體購于武漢博士德生物工程有限公司；Real Time－PCR逆轉錄試劑盒購于Toyobo公司；無噬菌體胎牛血清購于四季青生物有限公司，RPMI－1640培養基購于Hyclone，引物是由上海生物技術有限公司設計及合成，其余試劑均為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 THP－1細胞用含有10%無噬菌體FBS的 RPMI 1640培養液（另加入1.0×105μg／L青霉素和100μg／L鏈霉素），置于含5%CO2、37℃培養箱中靜置培養。實驗前預先用160nmol／L PMA處理細胞24h，誘導其分化為巨噬細胞。

1.2.2 實驗分組 分5組：對照組（正常巨噬細胞）、模型組（即泡沫細胞組）、姜黃素（1×10－6、1×10－5、1×10－4mol／L）處理組。對照組只加入RPMI1640培養液，模型組在RPMIl640培養液另加入50mg／L ox－LDL共同孵育48h；姜黃素處理組在RPMIl640培養液中加入不同濃度姜黃素（1×10－6、1×10－5、1×10－4mol／L）和50mg／L ox－LDL孵育細胞48h。

1.2.3 油紅O染色 參考文獻 ［12］的方法。

1.2.4 高效液相色譜法測定細胞內膽固醇酯含量 參考文獻 ［13］的方法。

1.2.5 膽固醇流出測定 參考文獻 ［13］的方法。膽固醇和磷脂流出率（%）＝［培養液中3H／總3H（培養液＋細胞內）］×100%。

1.2.6 Western blot 收集各組細胞，加入細胞裂解液，提取細胞的總蛋白，并用BAC試劑盒（按說明書操作）測定蛋白質濃度，用鼎國生物技術公司的SDS－PAGE凝膠試劑盒按說明書配置5%濃縮膠和8%分離膠進行電泳，每孔的上樣量50μg，條件恒壓80V20min，150V60min，電泳完畢后根據mark顯示，切取相應膠帶進行轉膜，轉膜前PVDF膜甲醇浸泡15min，轉膜條件為恒流220mA 2h，隨后用5%牛奶（TBST配置）封閉6h，加一抗（1∶2000）過夜，后TBST洗膜3遍，每次10min；辣根過氧化物酶標記二抗（1∶2000）室溫1.5h，PBS清洗3遍，每次10min。后用Tanon ECL熒光檢查儀，對結果進行檢測。結果用AlphaImager 2200圖像分析軟件進行分析，將各組細胞的ABCA1光密度值分別與內參β－actin光密度值進行比較，所得比值代表ABCA1蛋白的表達水平。

1.2.7 Real time－PCR 收集各組細胞，按康為的Trizol試劑盒說明書提取總RNA，分光光度計法標化RNA（A260／A280），按照逆轉錄試劑盒步驟，每20μl取1.5μg總RNA逆轉錄合成cDNA，反應條件為：35℃，10min，70℃，8s；再取2.5μl逆轉錄產物進行實時定量PCR，反應體系為25μl，以β－actin為內參。引物如下：ABCA1的引物序列：上游5'－TCC AGG CCA GTA CGG AAT TC－3'，下游5'－ACT TTC CTC GCC AAA CCA GTA G－3'，引物長度71bp。PCR 反應條件：50℃ 3min，95℃6min，95℃15s，55℃25s，75℃30s，共40個循環。用ΔΔCt來計算基因的表達水平，計算公式如下：ΔCt＝目的基因Ct值－β－actin基因Ct值；ΔΔCt＝實驗組ΔCt－對照組ΔCt；實驗組相對于對照組基因表達水平的倍數＝2－ΔΔCt。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 姜黃素對THP1巨噬細胞泡沫化的影響

用油紅O染色后，顯微鏡下觀察顯示，與對照組相比，泡沫細胞組由于細胞攝取大量的ox－LDL導致胞內脂質堆積，油紅O染色陽性細胞遍布視野，脂點呈花環狀位于細胞核周，而1×10－5mol／L及1×10－4mol／L姜黃素處理組，油紅O染色陽性細胞比細胞模型組明顯減少；而10－6mol／L姜黃素處理組的細胞與模型組相比無明顯差異（見圖1）。

圖1 FGF21對泡沫細胞形成的影響（×400）

2.2 姜黃素對THP1巨噬細胞源性泡沫細胞內游離膽固醇及膽固醇酯含量的影響

與對照組相比，模型組細胞內TC、FC和CE含量明顯增高（P＜0.05），CE／TC值為63.93%，與對照組有明顯的統計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，1×10－5mol／L及1×10－4mol／L姜黃素處理組細胞內TC、FC、CE含量及CE／TC均有明顯差異（P＜0.05）。而1×10－6mol／L姜黃素處理組TC、FC、CE以及CE／TC與模型組相比無明顯統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 姜黃素對THP1巨噬細胞源性泡沫細胞內游離膽固醇及膽固醇酯含量的影響

2.3 姜黃素對THP1源性巨噬細胞膽固醇流出的影響

為了進一步證明姜黃素對THP1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇代謝的影響，我們檢測了各組細胞的膽固醇流出率。與對照組（9.52%±1.94%）相比，模型組細胞（19.75%±1.85%）的膽固醇流出率明顯增加，具有統計學差異（P＜0.05）。與模型組相比，1×10－5mol／L（32.07%±2.86%）及1×10－4mol／L（42.56±2.76%）姜黃素處理組細胞的膽固醇流出率明顯增加（P＜0.01），而1×10－4mol／L姜黃素組與模型組相比膽固醇流出率并無明顯差別；1×10－6mol／L姜黃素處理組細胞的膽固醇流出率為（20.93%±2.73%），與模型組細胞無統計學差異（P＞0.05）。

2.4 姜黃素對THP1源性巨噬細胞ABCA1mRNA和蛋白表達的影響

Real time－PCR及Western blot結果顯示，與對照組相比，泡沫化的巨噬細胞ABCA1mRNA及蛋白表達明顯增高（見圖2）。與模型組相比，1×10－5mol／L和1×10－4mol／L姜黃處理組細胞內的ABCA1的mRNA和蛋白表達顯著增加（均P＜0.05），而1×10－6mol／L姜黃素處理組與模型組相比，ABCA1的mRNA和蛋白表達無明顯差異。

圖2 姜黃素對THP1源性巨噬細胞ABCA1表達的影響

3 討論

As的發生和進展是引起各種心腦血管疾病重要的病理生理基礎，防止動脈粥樣硬化的發生對預防各種心腦血管疾病具有重要的意義［14］。泡沫細胞的形成作為AS發生的核心環節，關系到斑塊的穩定和急性臨床事件的發生。因此，預防泡沫細胞的形成成為了預防AS發生進展的主要策略［2］。膽固醇的逆轉運作為外周組織轉運細胞多余膽固醇主要途徑，是防止脂質在外周組織蓄積的重要手段，是對抗AS發生的重要機制。ABCA作為調控膽固醇逆向轉運的重要蛋白，其表達的上調可以促進泡沫細胞膽固醇的代謝，脂質流出，抑制泡沫細胞形成［2，15］。

姜黃素是從姜黃中提取出來的天然色素，具有抗炎、抗氧化、降脂等作用［7－8］?，F有的國內外研究證明，姜黃素不僅對心肌有保護作用，同時也能通過上調ABCA1表達調控小鼠的認知功能，這表明姜黃素具備改善AD的潛能［16－17］。而最新的研究顯示姜黃素可以抑制動脈粥樣硬化的進展，但是具體的機制不明。Hasan等研究顯示在LDLR－／－小鼠中姜黃素可以抑制脂肪酸結合蛋白以及CD36表達，繼而抑制動脈粥樣硬化斑塊的的進展。Siddiqui等發現姜黃素可以通過調控NF－κB信號通路抑制炎癥因子（如IL－6、IL－8、MCP1、TNFα）等的表達［18］。此外，姜黃素還可以通過影響PPARγ的表達降低單核細胞趨化蛋白－1（MCP－1）、內皮素、血管細胞黏附分子－1（VCAM－1）的表達，抑制白細胞介素－6（IL－6）釋放，并抑制了NF－κB的活性等發揮拮抗慢性炎癥的作用，從而抑制As的進展［19］。而Jain科研團隊在糖尿病動物模型及相關的細胞模型實驗中也表明了姜黃素具有抗炎作用［20］。這些研究結果表明姜黃素具有抗動脈粥樣硬化的潛能，而這也得到了廣泛研究的證實，但是關于姜黃素在泡沫細胞膽固醇逆轉運中的作用，尚未見研究報道?；诖?，我們對姜黃素對泡沫細胞形成及其內膽固醇代謝進行研究，從AS發生的核心環節上，觀察姜黃素的作用，為姜黃素在防治AS的研究提供新的理論依據。

通過實驗，我們可以看出，姜黃素可以減少THP1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇的流出，減少膽固醇的蓄積。此外，我們的結果還顯示姜黃素可以上調ABCA1表達，而ABCA1作為調節細胞內膽固醇流出的重要蛋白，其表達的上調可以促進泡沫細胞內游離膽固醇的流出，抑制泡沫細胞的形成。LXRα、PPARγ、cAMP作為調節ABCA1表達的重要因子，它們對ABCA1表達的調控已經得到廣泛的認同，因此通過調控LXRα、PPARγ、cAMP表達可以調節ABCA1從而促進巨噬細胞膽固醇的流出，防止斑塊的進展［21］。而最近研究顯示，在脂肪細胞中姜黃素可以通過PPARγ－LXRα－ABCA1途徑促進脂肪細胞的膽固醇的流出，這表明姜黃素確實可以激活PPARγ－LXRα通路［22］。在本研究中我們只是初步的確探討黃素素對泡沫細胞的影響及機制，而關于姜黃素是否通過激活PPARγ－LXRα通路調節ABCA1表達的工作目前正在開展。通過目前我們的研究結果表明，姜黃素可以明顯的上調巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1的表達，從而介導細胞內膽固醇的流出，抑制泡沫細胞形成和發展。因此，通過本實驗研究我們得出姜黃素可以上調THP1源性巨噬細胞泡沫細胞內ABCA1表達，促進細胞內膽固醇的外流，抑制泡沫細胞的形成。而這為姜黃素在心血管領域的運用及AS藥物的研究提供新的方向。

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