不同產區碎米薺nrDNA ITS序列分析及親緣關系鑒定

向極釬+李錫香+王萌+殷紅清+帥超群+朱云芬

摘要：堇葉碎米薺、壺瓶碎米薺與恩施碎米薺存在命名混亂的現象，從植株外部形態來看難以區分。為研究其親緣關系，分別從4個有代表性的地點采集不同的居群，進行核糖體基因（nrDNA）的內轉錄間隔區（ITS）序列比較分析，并構建其系統發育樹。結果表明，所有4份材料ITS序列全長均為709 bp，其中來自宜昌長陽和五峰的材料堿基序列完全一致，與來自恩施和壺瓶的序列相比，分別有兩個堿基位點不同，4個群體的碎米薺（Cardamine hirsuta L.）可以聚為一支，居群之間的遺傳距離很近，為0～0.003，這種差異未超過一個種范圍內的變異，初步證明4個不同產地的碎米薺為同一個種，歸為堇葉碎米薺。

關鍵詞：碎米薺（Cardamine hirsuta L.）；核糖體nrDNA；內轉錄間隔區（ITS）；序列分析

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）19-4737-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.061

nrDNA ITS Sequences Analysis and Genetic Relationship Identification of Cardamine from Different Geographical Regions

XIANG Ji-qian1，2，LI Xi-xiang3，WANG Meng1，YIN Hong-qing1，2，SHUAI Chao-qun1，2，ZHU Yun-fen1，2

（1. Enshi Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences，Enshi 445002，Hubei，China；

2. Enshi Selenium Institute of Applied Technology and Product Development，Enshi 445002，Hubei，China；

3.Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081，China）

Abstract： Cardamine violifolia，Cardamine hupingshanensis and Cardamine enshiensis exist the phenomenon of confused naming. They are difficult to be distinguished from the external form of the plant. In order to study the genetic relationship of Cardamine hirsuta， different populations from four representative place were collect of. Ribosomal DNA（nrDNA） internal transcribed spacer（ITS） sequences were comparatively analyzed. The phylogenetic tree was constructed. The results showed that the full-length ITS sequences of all materials tested were 709 bp， consisted with the material base sequences from Changyang and the Wufeng. There were two base sites different from Enshi and Huping. The four groups of Cardamine hirsuta were in one cluster. The genetic distance between populations was between 0～0.003， not exceeding a range of variation. It is indicated that the Cardamine hirsuta of four different origins are the same species as the Cardamine violifolia.

Key words： Cardamine hirsuta L.； ribosomal DNA nrDNA； internal transcribed spacer （ITS）； sequence analysis

碎米薺（Cardamine hirsuta L.）[1]為十字花科碎米薺屬1～2年生草本植物，生長在海拔約1 000 m的山坡林下溝邊濕地，全國各地均有野生，是近年來研究較多的聚硒植物。壺瓶碎米薺（Cardamine hupingshanensis）由湖南師范大學劉林翰、劉克明發現并命名，主要分布在湖南北部的壺瓶山一帶[2]。2000年湖南農業大學向天勇[3]在湖北省恩施州硒礦區魚塘壩發現近似植物，并定名為恩施碎米薺（Cardamine enshiensis）。傅書遐[1]、彭誠等[4]將在此處發現的碎米薺鑒定為堇葉碎米薺（Cardamine violifolia），隨后白宏鋒等[5]將壺瓶碎米薺與近年來所報道的恩施碎米薺以及堇葉碎米薺歸為同一個種，孫紫薇等[6]分析了恩施漁塘壩地區碎米薺的形態特征與核型，發現該地區碎米薺存在居群間分化，屬堇葉碎米薺。王玉兵等[7]又把在湖北省五峰、長陽發現的近似植物鑒定為壺瓶碎米薺，2013年中國科學技術大學教授尹雪斌研究組將在湖北恩施發現的超富硒植物定名為壺瓶碎米薺。綜上所述，恩施碎米薺、堇葉碎米薺及壺瓶碎米薺存在命名混亂的情況，其命名在世界植物學界爭論激烈，且從植株外部形態來看非常接近，難以區分，均具有很高的硒富集能力。

高等植物的核糖體DNA（Ribosomal，rDNA）是由串聯重復的多拷貝序列組成，每個拷貝包括編碼區和內轉錄間隔區，編碼區包括18S、5.8S和26S基因，序列高度保守，進化速率慢，常用于探討分類學上科及以上分類單位的系統發育問題[8]；編碼區之間為內轉錄間隔區（Internal transcribed spacer， ITS），依順序分為第一轉錄間隔區（ITS1）和第二轉錄間隔區（ITS2）。ITS區域序列進化速率較編碼區快，可以提供較豐富的變異位點和信息位點，而且穩定性好、測序方便，已成為研究植物分類和親緣關系的有效工具和重要標記[9-12]。

本研究依據報道分別從湖北宜昌長陽崩尖子、宜昌五峰梨子坪、恩施雙河魚塘壩，湖南石門壺瓶山4個有代表性的地點采集不同的居群，進行核糖體基因（nrDNA）的內轉錄間隔區（ITS）序列比較分析，并構建其系統發育樹，從分子生物學角度探討恩施碎米薺、堇葉碎米薺及壺瓶碎米薺之間的親緣關系，以期為碎米薺的分類鑒定及系統發育等研究提供理論依據，為進一步探究碎米薺超聚硒生理特性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料于2013年4月分別采自不同的地點，每個種群取50株。采樣地點的情況見表1。4份材料外部形態見圖1。

1.2 DNA提取

分別稱取4個不同產區的碎米薺幼嫩葉片100 mg，經液氮冷凍研磨，采用改良CTAB法提取DNA[13]。取2 μL DNA樣品用0.8%的瓊脂糖進行電泳檢測。測定OD值，調整DNA濃度，分別等量混合群體的DNA。

1.3 引物設計

引物設計參照文獻[9]，分別為ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′），ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），由上海生物工程技術服務有限公司合成，擴增產物將依次包含部分的18S編碼區、ITS1、5.8S編碼區、ITS2、部分28S編碼區，預計大小為709 bp。

1.4 目的片段PCR擴增

ITS區擴增PCR反應體系體積為25 μL，包括模板1 μL（60 ng/μL），dNTP 2 μL（10 mmol/L），10×buffer 2.5 μL， Taq酶1μL（1 U/μL）；正反向混合引物1 μL（10 μmol/L）。 PCR 反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55.8 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；最后72 ℃保溫5 min，4 ℃保存。反應結束后， 取2 μL反應產物1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，在凝膠成像系統上觀察拍照。

1.5 測序及分析

將ITS區擴增產物送生工生物工程股份有限公司純化測序，在GenBank中搜索相近序列并下載，采用MEGA5.1軟件，鄰位相接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統樹，模型選擇Kimura-2-parameter，自展檢測1 000次。

2 結果與分析

2.1 DNA質量檢測

經電泳檢測，提取的碎米薺DNA質量較好，呈明亮的細線狀條帶（圖2）。將提取的DNA稀釋后測定其OD值，然后調整其濃度為30 ng/μL，分別等量混合每個群體的DNA。

2.2 PCR檢測與序列比對

分別以每個群體等量混合的DNA和隨機選取的單株DNA為模板進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示。其條帶清晰明亮，無雜帶，與理論設計長度基本吻合，PCR產物比較穩定。

經過序列的比對和校正，排除序列兩端不確定的堿基，最終獲得了4條序列，長度均為709 bp，4個群體的序列已登錄GenBank，登錄號見表1。通過MEGA5.1軟件對校正后的序列進行比對，4條序列比較一致，只有個別位點不同，來自宜昌五峰和長陽的2個居群的序列完全相同（表2）。

2.3 進化樹構建和遺傳距離分析

以QT-1為基準，在NCBI上進行BLAST比對，分別選擇下載最相似和得分最高的幾條序列，搜索核糖體ITS序列下的堇葉碎米薺（一條）、壺瓶碎米薺（無）和恩施碎米薺（無），只得到了一條堇葉碎米薺的序列，對上述序列和本試驗測序并校正的序列，利用MEGA5.1軟件鄰接法（Neighbor—Joining）構建進化樹，自展檢驗1 000次，選用kimura-2-parameter參數模型并且計算各序列間的遺傳距離，結果分別見圖4和表3。結果表明，試驗中4個碎米薺可以聚為一支，其遺傳距離很近，為0～0.003。

3 討論

ITS序列作為一種遺傳分子標記，與形態標記、生化標記和細胞學標記等技術手段相比，具有明顯的優越性。ITS區受外界環境影響較小，進化速度快，既具保守性又在科、屬、種水平上具有特異性，而且序列長度適中，含有足夠量的遺傳信息，不但可以廣泛用于物種間的鑒定，同時也被用于種內居群間的差異性分析。

試驗自測的4條ITS序列可以聚為一支，親緣關系很近，遺傳距離為0～0.003，來自宜昌長陽的QT-1和五峰的QT-2堿基序列是完全一致的，與來自湖南壺瓶山的QT-3和來自湖北恩施魚塘壩的QT-4分別有2個堿基位點的變異，通過與GenBank相近序列的比對，確定這些變異位點出現在ITS1區域。本研究中的DNA模板來自群體內的50個單株等量混合，因此這些位點的變異是可信的。自然狀態下的群體遺傳背景比較單一，來自宜昌、壺瓶和恩施的碎米薺可能有著共同的起源，在經歷了長時間的生殖隔離和進化后形成了不同的地方種。

在序列分析中，通過搜索GenBank里與堇葉碎米薺、壺瓶碎米薺、恩施碎米薺同名的核糖體ITS序列，找到了一條堇葉碎米薺的序列，但提到序列的有機體來源是露珠碎米薺（登錄號JF980320），無其他相關信息，從進化樹結果看來，該序列與本試驗所得的序列親緣關系比較遠，很可能不是同一物種。

綜上所述，本試驗比較了4個野生群體碎米薺ITS序列的差異，分析了其地理分布與ITS序列的相關性，結果表明這種差異未超過一個種范圍內的變異，初步證明4個不同產地的碎米薺為同一個種，歸為堇葉碎米薺。由于本研究只選取了產自湖北和湖南2個臨近省份的材料進行系統發育分析，其起源中心在哪里，它們與云南等較遠地區碎米薺居群間的遺傳變異程度還未做鑒定分析，有待進一步探討和研究。

參考文獻：

[1] 傅書遐.湖北植物志（第2卷）[M].武漢：湖北科學技術出版社，2002.

[2] 龍躍生.碎米薺屬一新種——壺瓶碎米薺（Cardamine hupingshanesis）的核型分析及其近緣種ITS序列進化的研究[D].長沙：湖南師范大學，2002.

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[6] 孫紫薇，施 波，石開明，等.湖北省恩施高硒地區碎米薺的形態特征與核型分析[J].江蘇農業科學，2010（2）：199-200.

[7] 王玉兵，陳發菊，梁宏偉.湖北省碎米薺屬一新記錄種——壺瓶碎米薺[J].湖北農業科學，2110，49（9）：2160-2161.

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[13] 孫志棟，王學德，倪西源，等.棉花DNA提取方法的探討[J].浙江農業學報，16（4）：177-181.

綜上所述，本試驗比較了4個野生群體碎米薺ITS序列的差異，分析了其地理分布與ITS序列的相關性，結果表明這種差異未超過一個種范圍內的變異，初步證明4個不同產地的碎米薺為同一個種，歸為堇葉碎米薺。由于本研究只選取了產自湖北和湖南2個臨近省份的材料進行系統發育分析，其起源中心在哪里，它們與云南等較遠地區碎米薺居群間的遺傳變異程度還未做鑒定分析，有待進一步探討和研究。

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