響應曲面法優化亞麻籽蛋白提取工藝

徐江波，肖江，陳元濤，*，張煒，郭智軍

（1.青海師范大學潤德亞麻籽工程技術研究中心，青海西寧810008；2.青海師范大學化學系，青海西寧810008）

亞麻（Linum usitatissimum L.），亞麻科、亞麻屬的一年生或多年生草本植物[1]，主要分布在北美、印度、中國等國家，是世界上最古老的纖維作物，品種較多，已成為世界十大油料作物之一[2-4]。亞麻籽（flaxseed或linseed）是亞麻的種子，含有油脂和蛋白質等營養成分。其中，脂肪占31.9%～37.8%，含有多種脂肪酸，尤其不飽和脂肪酸含量很高；蛋白質占21.9%～31.6%，含有幾乎所有種類的氨基酸，且氨基酸的評分較高，具有很高的營養價值[2]；另外，亞麻籽中還含有一定量的亞麻籽膠，隨品種和栽培區域不同而不同，約占種子質量的2%～10%[5]。諸多文獻[6-9]研究表明，油料蛋白質的提取主要有等電點沉淀、離子交換、堿溶酸沉法、反膠束溶液萃取、膜分離、酶法等方法，其中堿溶酸沉法是我國普遍采用的蛋白質提取工藝，該方法能夠有效地提高蛋白質的提取率，充分利用蛋白質資源。

響應曲面法（Response Surface Methodology）是利用合理的實驗設計并通過對實驗數據進行一定的處理，建立影響因素與響應值之間的函數關系，采用多元二次回歸方程來擬合影響因素與響應值之間的函數關系，并通過對回歸方程的分析來尋求最佳工藝參數，解決多變量問題，由于其精度高，目前在食品工業和天然產物開發研究過程中應用廣泛[10-11]。

目前，盡管亞麻籽中含有大量的亞麻籽蛋白，但在我國應用亞麻籽提取亞麻籽蛋白的文獻很少，更未見有規?；a亞麻籽蛋白的報道[12]。這是由于亞麻籽中富含亞麻籽膠，其具有黏性大、吸水性強、乳化效果強等特點[13-15]，會造成亞麻籽蛋白在提取過程中乳化、難離心、不易過濾等問題。因此，在對亞麻籽進行蛋白質的提取過程中，應該先對亞麻籽膠進行預處理。本課題組首先采用果膠酶法[16]對亞麻籽進行脫膠預處理，然后粉碎脫脂后采用響應曲面分析法優化亞麻籽蛋白堿溶酸沉的工藝條件，探討料液比、浸提pH、浸提時間和浸提溫度4個因素對亞麻籽蛋白提取率的影響，確定最佳的工藝參數，為亞麻籽蛋白的進一步開發利用及規?；a提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

亞麻籽：青海潤德生物科技有限公司，挑選完整、飽滿、無蟲害的亞麻籽作為實驗原料；果膠酶（酶活力 10000 U/mL）：諾維信（中國）生物技術有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、石油醚：北京化學試劑廠；以上試劑及其它化學試劑均為分析純；蒸餾水：青海師范大學化學實驗中心自制。

1.2 儀器與設備

pH計：梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；LXJ-64-01離心機：北京醫療儀器修理廠；分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；LGJ-22型冷凍干燥機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；DHG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；雙層玻璃反應釜：上海申生科技有限公司；K360 BUCHI步琪凱氏定氮儀：廣州和竺生物科技有限公司；ZD-2上海雷磁自動電位滴定儀：上海恒磁電子科技有限公司；超級恒溫器：上海市實驗儀器廠；索氏抽提器：北京欣維爾玻璃儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 亞麻籽粉基本組成成分測量

水分測定：常壓直接干燥法，參照GB 5009.3-2010《食品安全國家標準食品中水分的測定》；蛋白質的測定按照GB/T 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》；灰分的測定采用灼燒重量法，按照GB/T 5009.4-2010《食品安全國家標準食品中灰分的測定》；脂肪的測定采用索實提取器，按照GB/T 14772-2008《食品中粗脂肪的測定》；總纖維的測定按照GB/T 5009.10-2003《植物類食品中粗纖維的測定》。

1.3.2 亞麻籽蛋白的制備

1.3.2.1 原料預處理

首先用果膠酶對亞麻籽進行脫膠處理，然后將脫膠干燥后的亞麻籽進行粉碎，并在常溫下用石油醚脫脂3次，置于通風櫥中12 h以揮發溶劑，得脫脂粉，于冰箱5℃保存備用。脫脂亞麻籽粉中蛋白質含量采用凱式定氮法進行測定。

1.3.2.2 亞麻籽蛋白的制備工藝流程

亞麻籽→果膠酶脫膠→干燥→粉碎（過80目篩）→脫脂→堿溶浸提→離心→等電點沉淀→離心→洗滌→冷凍干燥→亞麻籽蛋白粉

1.3.2.3 亞麻籽蛋白的具體提取步驟[17-18]

稱取一定量脫膠脫脂亞麻籽粉與蒸餾水按一定料液比混合，用NaOH調至一定的pH，于一定溫度下攪拌浸提30 min，然后在以 4000 r/min離心20 min。沉淀物再重復提取1次，合并2次上清液，用HCl調pH至等電點使蛋白質沉淀，再以4000r/min離心20min，用蒸餾水洗滌沉淀2次，再用NaOH回調至pH為7.0，攪拌使沉淀復溶后進行冷凍干燥，則可得到亞麻籽蛋白粉。

1.3.3 堿溶酸沉提取亞麻籽蛋白試驗

1.3.3.1 等電點的確定

稱取10.0 g亞麻籽脫脂粉，料液比為1∶20（g/mL），用NaOH調節pH至10.0，控制溫度為50℃下攪拌浸提30 min，然后在以 4000 r/min離心20 min。沉淀物再重復提取1次，合并2次上清液，分別取上清液9份各25 mL，加鹽酸調節 pH 為 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5后離心，棄上清液后稱重，將上述過程重復一次，繪出沉淀量與pH的曲線關系圖，圖中沉淀量最大時的pH即為亞麻籽蛋白質的等電點。

1.3.3.2 料液比的確定

分別設定料液比為 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL），50℃，pH 為 10.0下浸提 90 min，研究料液比對蛋白質提取率的影響，確定最佳的料液比。

1.3.3.3 浸提pH的確定

料液比選擇1∶20（g/mL），分別選擇浸提pH為8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，溫度為 50 ℃下浸提 90 min，研究浸提pH對蛋白質提取率的影響，確定最佳的浸提pH。

1.3.3.4 浸提溫度的確定

料液比選擇1∶20（g/mL），分別選擇浸提溫度為20、30、40、50、60、70 ℃，pH 為 10.0 下浸提 90 min，研究浸提溫度對蛋白質提取率的影響，確定最佳的浸提溫度。

1.3.3.5 浸提時間的確定

料液比選擇1∶20（g/mL），分別選擇浸提時間為30、50、70、90、110、130 min，在 pH 為 10.0 和溫度為50℃下，研究浸提時間對蛋白質提取率的影響，確定最佳的浸提時間。

1.3.4 堿溶酸沉工藝優化試驗

依據單因素試驗的結果，采用Box-Behnken進行試驗設計，以料液比（g/mL）、浸提溫度（℃）、浸提pH及浸提時間（min）為影響因素，采用四因素三水平的響應曲面法進行試驗，利用Design-Expert8.0.5b軟件進行數據的處理和回歸分析。分別用A、B、C、D來表示4個影響因素，并用+1、0、-1分別代表變量的水平，亞麻籽蛋白提取率為響應值，試驗設計方案[19]見表1。

表1 響應面設計實驗因素與水平Table 1 Variables and levels in response surface design

1.4 分析方法

1.4.1 亞麻籽粗蛋白含量的測定

凱式定氮法。

1.4.2 亞麻籽蛋白得率的計算

亞麻籽蛋白得率（%）=粗提產物中蛋白質含量/脫脂粉總蛋白質含量×100%

2 結果與討論

2.1 脫膠脫脂亞麻籽粉基本組分測定結果

對脫膠脫脂后的亞麻籽粉進行成分測定，結果見表2。

表2 亞麻籽粉基本組分Table 2 The basic components of flaxseed meal

2.2 亞麻籽蛋白等電點的測定

堿溶酸沉法提取蛋白質的過程中，加酸至等電點是非常關鍵的一步。在等電點時，蛋白質的沉淀量會達到最大值，見圖1。

從圖1中可以看出，當酸沉pH達到4.5時，亞麻籽蛋白的沉淀量最大，故選擇酸沉pH為4.5作為亞麻籽蛋白的等電點。

2.3 蛋白質提取單因素試驗結果

2.3.1 料液比對蛋白質提取率的影響

按照1.2.2.2方法進行試驗，得到料液比對蛋白質提取率的影響試驗結果如圖2所示。

圖1 亞麻籽蛋白等電點Fig.1 The isoelectric of flaxseed protein

圖2 料液比對蛋白質提取率的影響Fig.2 Relationship between ratio of flaxseed to solution and extraction rate of flaxseed protein

從圖2可以看出，蛋白質提取率隨著料液比的增大而增加，當料液比增大到1∶20（g/mL）時蛋白質提取率達到最大值，此后隨著料液比的增大蛋白質提取率已趨于平衡，沒有明顯變化。因此，考慮到經濟成本及后續實驗的處理過程，本實驗選擇料液比為1∶20（g/mL）作為最佳的料液比參數。

2.3.2 浸提pH對蛋白質提取率的影響

按照1.2.2.3方法進行試驗，得到浸提pH對蛋白質提取率的影響試驗結果如圖3所示。

圖3 浸提pH對蛋白質提取率的影響Fig.3 Relationship between extraction pH and extraction rate of flaxseed protein

由圖3可以看出，隨著浸提pH的升高，亞麻籽蛋白提取率隨之增加，在浸提pH=10.0時蛋白質提取率達到最大值。當浸提pH繼續增大，蛋白質提取率反而會下降，造成的原因可能是浸提pH太高引起了部分蛋白質變性，使得提取率反而會下降。因此，本實驗選擇浸提pH=10.0作為最佳的浸提pH。

2.3.3 浸提溫度對蛋白質提取率的影響

按照1.2.2.4方法進行試驗，得到浸提溫度對蛋白質提取率的影響試驗結果如圖4所示。

圖4 浸提溫度對蛋白質提取率的影響Fig.4 Relationship between extraction temperature and extraction rate of flaxseed protein

由圖4可以看出，浸提溫度對亞麻籽蛋白提取率有較大的影響。在20℃～50℃，亞麻籽蛋白提取率隨浸提溫度的增大而增加，當溫度達到50℃時，蛋白質提取率達到最大；當溫度繼續升高時，蛋白質提取率明顯降低，造成該現象的原因是：當溫度小于50℃時，隨著溫度的升高蛋白質的溶解度會隨之增大，而浸提溫度過高則導致部分蛋白質發生變性，反而不利于提取。因此，本實驗選擇浸提溫度為50℃作為最佳的浸提溫度。

2.3.4 浸提時間對蛋白質提取率的影響

按照1.2.2.5方法進行試驗，得到浸提時間對蛋白質提取率的影響試驗結果如圖5所示。

圖5 浸提時間對蛋白質提取率的影響Fig.5 Relationship between extraction time and extraction rate of flaxseed protein

由圖5可以看出，當浸提時間小于90 min時，亞麻籽蛋白提取率隨著浸提時間的增長而提高；當浸提時間大于90 min時，亞麻籽蛋白提取率有緩慢的下降趨勢。原因可能是：當提取時間小于90 min時，提取率比較低，這是由于亞麻籽脫脂粉的溶脹需要一定的時間；若時間過長，整個提取過程的平衡會被破壞，可能使部分蛋白質變性，而且浸提時間過長，從經濟上考慮會增加生產成本，因此，綜合各個因素考慮，本試驗選擇浸提時間為90 min作為最佳的浸提時間。

2.4 堿溶酸沉提取工藝的優化

2.4.1 試驗結果

采用四因素三水平的響應曲面法進行堿溶酸沉提取亞麻籽蛋白工藝的優化，按照1.2.3的設計方案進行試驗，結果見表3。

表3 方案設計及響應面法試驗結果Table 3 Response surface experimental design and results

2.4.2 模型的建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert 8.0.5.0軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，得到亞麻蛋白質得率對A料液比（g/mL）、B浸提溫度（℃）、C浸提pH及D浸提時間（min）的二次多項回歸模型為：Y（%）=78.69+3.85A－3.27B+1.93C+1.58D+0.18AB －0.56AC －1.82AD －0.71BC+3.17BD+5.91CD －3.59A2－10.02B2－7.44C2－5.18D2。

對該模型進行顯著性檢驗及回歸模型系數顯著性結果（見表4）分析得出，該二次回歸方程的模型項、一次項 A、B，二次項 A2、B2、C2、D2和交互項 CD 都表現出極顯著影響，一次項C，交互項BD都表現出顯著影響，而且失擬項不顯著，表明該模型有顯著意義。為了簡化二次回歸方程，剔除偏回歸系數不顯著的AB、AC、BC、AD項，簡化可建立如下二次回歸模型為：Y（%）=78.69+3.85A-3.27B+1.93C+1.58D+3.17BD+5.91CD-3.59A2-10.02B2-7.44C2-5.18D2。

表4 實驗結果的方差及顯著性分析Table 4 Variance and significance analysis of the experimental results

由表3可以看出，回歸模型具有高度的顯著性（P＜0. 0001），失擬性具有不顯著性（P=0. 9744＞0.05），且回歸模型的R2=0. 9360＞0.9，表明模型充分擬合實驗數據，因此二次模型成立，應用此模型可以分析和預測亞麻籽蛋白質堿溶酸沉提取工藝的優化。由表3擬合二次多項式模型的方差及顯著性分析的結果可知，模型的一次項A、B均顯著，C差異顯著，D不顯著，二次項均顯著，交互相CD顯著，BD為差異顯著，其他交互相均不顯著。由F值可知，影響亞麻籽蛋白提取率的因素依次為A＞B＞C＞D，即料液比＞浸提溫度＞浸提pH＞浸提時間。

2.4.3 兩交互因素之間的作用

等高線的形狀反映了各因素之間交互效應的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。由表4的顯著性分析及等高線圖可知，浸提時間和浸提溫度（BD）、浸提時間和浸提pH（CD）的交互作用對亞麻蛋白質的提取率的影響顯著。具體分析如下。

圖6 浸提時間和浸提溫度交互作用對蛋白質提取率的影響Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction temperature and time on extraction efficiency of flaxseed protein extraction yields

圖6表示料液比為1∶20（g/mL），浸提pH為10.0時，浸提時間與浸提溫度對亞麻蛋白質的提取率的影響。當浸提時間一定時，亞麻蛋白質的提取率隨著浸提溫度的升高先增加后減小，在提取溫度小于50℃時，亞麻蛋白質的提取量是隨之增加的；當浸提溫度一定時，亞麻蛋白質的提取量隨浸提時間的增長而增大，當時間超過1.5 h時，蛋白質提取率也會趨于平緩。

圖7 浸提時間和浸提pH交互作用對蛋白質提取率的影響Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction pH and time on extraction efficiency of flaxseed protein extraction yields

圖7表示料液比為 1∶20（g/mL），浸提溫度為50℃時，浸提時間與浸提pH對亞麻蛋白質的提取率的影響。當浸提時間一定時，亞麻蛋白質的提取率隨著浸提pH的升高先增加后減小，在提取pH小于10.0時，亞麻蛋白質的提取量是隨之增加的；當浸提pH一定時，亞麻蛋白質的提取量隨浸提時間的增長而增大，當時間超過1.5 h時，蛋白質提取率也會趨于平緩。

2.4.4 亞麻籽蛋白提取條件的優化

通過用Design Expert 8.0.5.0軟件分析，堿溶酸沉提取亞麻籽蛋白的最佳工藝條件如表5。

表5 最佳提取率的各個因素組合Table 5 Optimum extraction rate of various combinations of factors

由表5可知，堿溶酸沉提取亞麻籽蛋白的最佳工藝參數為：料液比 1∶20（g/mL），浸提溫度為 48.4℃，浸提pH為10.09，浸提時間為89.6 min，在此條件下，亞麻籽蛋白的提取率理論值為79.26%。為了檢驗響應曲面法所得的結果的可靠性，采用上述優化提取條件進行亞麻蛋白質提取試驗，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數修正為：料液比1∶20（g/mL），浸提溫度為48℃，浸提pH為10.0，浸提時間為90 min。在此條件下進行提取，實際測得的亞麻蛋白質的提取率為78.47%，與理論值79.26%比較接近。因此，建立的二次型模型與實際情況基本吻合。

3 結論

1）本實驗采用響應曲面法對堿溶酸沉法提取亞麻籽中的蛋白質工藝進行分析優化，建立的二次多項式數學模型具有良好的顯著性。堿溶酸沉提取亞麻籽蛋白的最佳工藝條件為：浸提溫度為50℃，料液比1 ∶20（g/mL），浸提 pH 為 10.0，浸提時間為 90 min，理論上的亞麻蛋白質的提取率可達79.26%，實際其提取率為78.47%。同時，在本實驗的范圍內，各影響因素對蛋白質提取率的作用大小依次為：料液比＞溫度＞浸提pH＞浸提時間。

2）利用果膠酶對亞麻籽進行脫膠的預處理之后，再來提取亞麻籽蛋白質，為亞麻籽蛋白資源的進一步開發提供基礎理論研究技術。

[1] 周瑞寶．特種植物油料加工工藝[M].北京：化學工業出版社,2010：370-371

[2] BeMiller,James N,Roy L.Whistler,eds.Industrial gums：polysaccharides and their derivatives[M].Academic Press,1993,234-237

[3] Mazza G,Biliaderis C G.Functional properties of flax seed mucilage[J].Journal of Food Science,1989,54(5)：1302-1305

[4] 陳海華,許時嬰,王璋.亞麻籽膠化學組成和結構的研究[J].食品工業科技,2004,25(1)：103-105

[5] 陳海華．亞麻籽的營養成分及開發利用[J]．中國油脂,2004,29(6)：72-74

[6] 湯茜．堿溶酸沉法制備火麻仁蛋白工藝研究[J]．中國釀造,2011,228(3)：108-110

[7] 魯子賢．蛋白質和酶學的研究方法[M]．北京：科學出版社,1998：37-39

[8] 趙曉燕,陳復生,薛文通,等．不同反膠束體系提取大豆蛋白質的研究[J]．食品科學,2007,28(4)：109

[9] 張敏,程志飛,王鵬．不同酶解條件對米糠蛋白提取率影響的研究[J]．食品科學,2008,29(9)：178

[10]Guan J,Fang Q,Hanna M A.Selected functional properties of extruded starch acetate and natural fibers foams[J].Cereal chemistry,2004,81(2)：199-206

[11]楊文雄,高彥祥.響應面法及其在食品工業中的應用[J].中國食品添加劑,2005(2)：62-71

[12]胡曉軍.亞麻籽加工產業現狀及對策[J].糧油食品科技,2009,17(6)：28-30

[13]鹿保鑫,楊健,劉婷婷.亞麻膠提取工藝的研究[J].黑龍江農業科學,2007(3)：95-97

[14]張文賓,許時嬰.亞麻籽粘質物質的脫除工藝[J].食品與生物技術學報,2006,25(3)：93-98

[15]Fedeniuk RW,Biliaderis CG,Composition and physicochemical properties of linseed(Linum usi tatissimum L.)mucilage[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1994,42(2)：240-247

[16]肖江,陳元濤,張煒,等.酶法脫除亞麻籽膠的工藝研究[J].食品科技,2012,37(12)：151-154

[17]鄧紅,田蕓蕓,田子卿,等．響應面曲線優化文冠果種仁蛋白的堿溶酸沉提取工藝[J].食品工業科技,2010,31(8)：197-200

[18]李靜娟,易建華,朱振寶．響應面法優化桃仁蛋白提取工藝[J].中國油脂,2010,35(12)：20-23

[19]劉進杰,張玉香,馮志彬,等.超聲波提取蓮花粉多糖工藝[J].食品科學,2011,32(18)：44-48