煙草青枯病菌生防菌的篩選和鑒定

畢濤+劉群+王曉強+李向東+陳曉紅+溫亮+蘇建東+楊舉田

摘 要：采用紙碟片法篩選到4株對煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）有抑菌作用的生防菌C2c、C1a、Tsb和Ch1b，抑菌圈直徑分別為51.50、25.95、24.40 mm和20.05 mm。通過16S rDNA序列分析，C2c、C1a和Tsb為多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa），Ch1b為成團泛菌（Pantoea agglomerans）。這4株生防菌對煙草赤星病菌（Alternaria alternate）、煙草根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、蘋果霉心病菌（Trichothecium roseum）等病原真菌也有較好的抑制作用。

關鍵詞：煙草青枯病菌；生防菌；紙碟片法

中圖分類號：S435.72+S476 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）11-0068-04

由青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的青枯病是煙草上最具毀滅性的細菌性病害，已經成為我國煙葉生產的主要制約因素。

煙草青枯病的生物防治越來越引起重視?？追裁鞯龋?999）[1]認為生防菌可以減輕發病程度，在接種青枯菌前噴施生防菌防病效果更好。羅寬等（2002）[2]篩選到3株青枯菌拮抗菌，并通過大田試驗驗證其防效。尹華群等（2004）[3]篩選到1株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）及2株短芽孢桿菌（Bacillus brevis）。張伏軍等（2007）[4]、胡軍華等（2009）[5]分離到1株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），盆栽試驗表明，先施用生防菌菌液或活性物質的防治效果要高于農用鏈霉素，后施菌液或活性物質也有一定的防治效果。段燕平等（2012）[6]分離得到1株枯草芽孢桿菌（B. subtilis），防治效果達66.70%。

本研究希望篩選更多的生防菌，鑒定其種屬地位并測定其抑菌譜，為煙草青枯病的生物防治提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病菌 煙草青枯病菌、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、蘋果霉心病菌（Trichothecium roseum）、玉米彎孢霉葉斑病菌（Curvularia lunata）和玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）由本實驗室分離保存；白地霉（Geotrichum candidum）由密西西比州立大學呂士恩老師提供；煙草赤星病菌（Alternaria alternate）、煙草根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）和蘋果炭疽病菌（Gleosporium fructigenum）由山東農業大學張廣民老師提供。

1.1.2 菌株、載體和生化試劑 大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株由本實驗室保存?？寺≥d體pMD18-T購自TaKaRa公司。細菌全基因組DNA提取試劑盒購自天根公司。PCR產物回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、dNTPs、DNA Marker（Trans 2K Plus，Trans 15K Plus）等購自全式金公司。其它生化試劑及普通化學試劑均為進口或國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙草青枯病菌生防菌篩選 將滅菌的150 mL NA 固體培養基加熱溶化完全，冷卻至55℃左右，倒入直徑為90 mm的培養皿內，每皿15 mL，凝固后備用。

根據袁從陽（2010）[7]的方法篩選生防菌株。采集小麥和煙草根際土壤，制備菌懸液，均勻涂布在NA培養基平板上，28℃培養24 h。將孢子濃度為1.0×105個/mL的白地霉（Geotrichum candidum）孢子懸液均勻噴布在長出細菌菌落的NA平板上，28℃培養24 h。選取周圍出現明顯抑菌圈的菌落，劃線法純化生防菌株。

采用紙碟片法驗證生防菌株對煙草青枯病菌的生防活性。在NA培養基平板中央放置直徑為7 mm的無菌紙碟片，用微量移液器在紙碟片上滴加濃度為1.0×108 cfu/mL的生防菌菌懸液10 μL，以無菌水為對照，待培養基充分吸收后，倒置于28℃恒溫培養箱24 h。將平板轉移至通風櫥，用濃度為1.0×108 cfu/mL的煙草青枯病菌菌懸液均勻噴灑在平板表面，使霧化菌懸液自然散落于藥劑平板上。待平板充分吸收菌懸液后封口，倒置于28℃恒溫培養箱內培養，分別在24、48 h后檢查抑菌效果，十字交叉法測量抑菌圈直徑，記錄抑菌圈透明度，篩選抑菌效果突出的生防菌株。試驗重復3次，每個菌株每次3個培養皿。

1.2.2 生防菌16S rDNA序列測定和分析 利用天根細菌全基因組DNA提取試劑盒提取對煙草青枯病菌有明顯抑制作用的生防菌株的全基因組DNA。利用引物16S-8-F（5′-CAC GGA TCC AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3′）和16S-1510-R（5′-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3′）擴增菌株的16S rDNA基因。擴增體系為：10× PCR Buffer 2.5 μL，dNTP （2.5 mmol/ L）1.0 μL，16S-8-F （10 moL/L） 1.0 μL，16S-1510-R （10 moL/L）1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶0.125 μL，加ddH2O至終體積25.0 μL。以ddH2O替代模板的體系作為陰性對照。擴增程序為94℃ 3 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min 50 s，30個循環；72℃ 10 min。反應結束后，將PCR 產物置于0.8% 瓊脂糖凝膠進行電泳分析，然后在凝膠成像儀中觀察并記錄結果。切膠回收目的片段，連接到pMD18-T載體，轉化大腸桿菌，提取重組質粒，送測序公司測序。將序列在NCBI上BLAST，并將其與GenBank序列比對并構建系統發育樹。endprint

1.2.3 生防菌對病原真菌的抑菌作用 將滅菌的150 mL PDA 固體培養基加熱溶化完全，冷卻至55℃左右，倒入培養皿內，每皿15 mL，凝固后備用。

采用紙碟法，在預先準備的直徑為90 mm的PDA平板上均勻對稱放置直徑為7 mm的紙碟片，在紙碟片上滴加濃度為1.0×108 cfu/mL的生防菌菌懸液10 μL，待培養基將生防菌充分吸收后，倒置于28℃培養箱培養24 h，將平板轉移到通風櫥內噴施濃度1.0×105個/mL供試病原真菌（見表1）孢子懸浮液，密封并將其轉移到28℃恒溫培養箱培養，7 d后十字交叉法測量抑菌圈直徑。以不加生防菌液的紙碟為對照。每菌株重復3皿。

2 結果與分析

2.1 煙草青枯病菌生防菌篩選

通過初篩，從100多個樣品中得到24株有拮抗作用的菌株，利用紙碟法篩選到4株對煙草青枯病菌有良好抑制作用的拮抗菌株。接種煙草青枯病菌24 h后，生防菌株C2c的抑菌圈直徑達到51.50 mm，抑菌圈半透明； C1a、Tsb和Ch1b抑菌圈直徑分別為25.95、24.40 mm和20.05 mm，抑菌圈透明。接種煙草青枯病菌48 h后，生防菌株Tsb和C1a對青枯菌的抑菌圈直徑沒有變化，但透明度變為半透明；生防菌株C2c和Ch1b的抑菌圈大小和透明度都沒有變化。

2.2 生防菌16S rDNA序列測定和分析

通過PCR，擴增到C2c、C1a、Tsb和Ch1b的16S rDNA目的片段，大小約為1 500 bp。測序后發現：C2c、C1a和Tsb的16S rDNA序列為1 517 nt，BLAST結果顯示，其與多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）16S rDNA序列一致率最高；Ch1b的16S rDNA序列為1 504 nt，與成團泛菌（Pantoea agglomerans）序列一致率最高。從系統發育樹上可以發現，生防菌C2c、C1a和Tsb 與多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa）聚類到一支（圖1），Ch1b與成團泛菌（P. agglomerans）聚類到一支（圖2）。

2.3 生防菌對病原真菌的抑菌作用

Tsb對玉米小斑病菌和玉米彎孢霉病菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑分別為33.70 mm和30.05 mm，對煙草赤星病菌和煙草根黑腐病菌也有很好的抑菌效果，抑菌圈直徑分別為29.40 mm和27.50 mm；C1a對玉米彎孢霉病菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑為32.75 mm，其次為煙草根黑腐病菌和煙草赤星病菌，抑菌圈直徑分別為28.05 mm和27.75 mm；C2c對玉米彎孢霉病菌的抑菌圈直徑為30.05 mm，對煙草根黑腐病菌和煙草赤星病菌的抑菌圈直徑分別達28.40 mm和24.75 mm，另外，其對蘋果霉心病菌和玉米小斑病菌也有很好的抑菌效果；Ch1b 對玉米彎孢霉病菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑為24.00 mm，對其他病原菌有一定的抑菌效果，對煙草赤星病菌和煙草根黑腐病菌的抑菌圈直徑分別為16.40 mm和12.00 mm。

3 討論

多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa）在多種作物上有促生及抑菌抗病作用，我國農業部已將多粘類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）列為免做安全鑒定的一級菌種[8]。Egamberdiyeva（2007）[9]證實多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa）可促進玉米對氮、磷、鉀等營養物質的吸收從而起到促生作用。已有報道稱，多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa）對包括黃瓜枯萎病和番茄枯萎病[10]、油菜腐爛病[11]和番茄青枯病[12]在內的多種病害有防治作用。本研究從小麥和煙草根際土壤中分離到3株多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa），室內試驗證明其對煙草青枯病菌（R. solanacearum）有很好的抑制作用，對包括煙草赤星病菌（A. alternate）、蘋果霉心病菌（T. roseum）和棉花枯萎病菌（F. oxysporum）在內的多種病原真菌都有很好的抑制作用。

沈德龍等（2000）[13]鑒定1株對水稻有很好促生效果的水稻內生優勢菌為成團泛菌（P. agglomerans）。洪永聰等（2001）[14]從稻谷上分離得到2株水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae）拮抗菌，1株成團泛菌（P. agglomerans）和1株分散泛菌（Pantoea dispersa）。薛夢林（2006）[15]篩選到1株冬棗采后病菌細交鏈格孢（Alternaria alternata）的拮抗菌，鑒定為成團泛菌（P. agglomerans），它可明顯降低棗果采后發病率，且與藥劑撲海因混用后，防病效果更好。本研究首次報道了成團泛菌（P. agglomerans）對煙草青枯病菌（R. solanacearum）的抑菌作用。

參 考 文 獻：

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