丹紅注射液對脂多糖誘導THP-1巨噬細胞促炎因子分泌的影響及機制

， ，(.南華大學附屬第二醫院心血管內科，湖南 衡陽 400；.南華大學附屬第二醫院病理科)

丹紅注射液對脂多糖誘導THP-1巨噬細胞促炎因子分泌的影響及機制

曾海燕1，方勇2，曾高峰1
(1.南華大學附屬第二醫院心血管內科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第二醫院病理科)

目的觀察丹紅注射液對脂多糖(LPS)誘導的THP-1巨噬細胞促炎因子分泌的影響，并探討其機制。方法160 nmol/L佛波酯孵育THP-1巨噬細胞24 h后分為對照組、脂多糖組、丹紅組和脂多糖+丹紅組，酶聯免疫吸附法檢測培養液中促炎因子的含量，Western blot檢測核因子κB(NF-κB)、p65和Toll樣受體4(TLR4)的蛋白表達水平。結果丹紅注射液明顯抑制LPS誘導的巨噬細胞腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)和白細胞介素1β(IL-1β)釋放，下調核因子NF-κB和TLR4的表達。結論丹紅注射液抑制脂多糖誘導的炎癥反應，可能與其抑制TLR4和NF-κB的表達有關。

丹紅注射液； 促炎因子； 核因子κB； Toll樣受體4； 動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是一種以動脈壁脂質蓄積為特征的慢性炎癥疾病[1]。各種炎癥細胞和炎癥因子參與As的發生和發展過程。研究證實，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)和白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)等炎癥因子可通過相互誘導、相互協同共同參與As的發生與發展過程[2]。丹紅注射液由丹參和紅花兩種主要藥效成分組成，功用為活血化淤、通脈舒絡，已用于臨床治療冠心病、高血壓和腦血栓形成等心血管疾病[3]。研究表明，丹紅注射液可抑制實驗性兔As的形成，顯著降低高脂誘導的家兔血漿總甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)及低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)水平，下調主動脈壁上的炎性因子[4-5]。此外，靜脈輸注丹紅注射液能有效治療下肢As疾病[6]。然而，丹紅注射液的抗As機制還不甚清楚，為了進一步研究丹紅注射液抗As的作用及可能機制，本研究用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激THP-1細胞源性巨噬細胞分泌TNF-α等促炎因子，再觀察丹紅注射液對促炎因子釋放的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

THP-1細胞購于中科院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞中心；RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；丹紅注射液購自菏澤步長制藥有限公司(10 mL/支)；佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)購自美國Sigma公司；小牛血清購自杭州四季青公司；TNF-α、IL-6和IL-1β酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自R&D Systems公司；核因子κB(NF-κB)、 p65兔抗人一抗購自Santa Cruze公司； Toll樣受體4(TLR4)兔抗人一抗購自R&D Systems公司；β-actin鼠抗人一抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自武漢博士德公司。

1.2 細胞培養及分組

人THP-1單核細胞株培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中(37 ℃、5%CO2)。培養液中加10 mmol/L的羥乙基哌秦乙硫磺酸(HEPES)和青霉素、鏈霉素各1.0×105U/L。在每次實驗前用160 nmol/L佛波酯(PMA)誘導THP-1細胞12 h使其誘導分化成巨噬細胞。細胞分為對照組、LPS組、丹紅組和LPS+丹紅組。對照組不加任何干預；LPS組為培養液中加入LPS(10 ng/mL)培養24 h；丹紅組為培養液中加入丹紅注射液(30 mL/L)培養24 h；LPS+丹紅組為培養液中同時加入10 ng/mL LPS和30 mL/L的丹紅注射液共培養24 h。

1.3 ELISA測定各組細胞培養上清液TNF-α、IL-6和IL-1β含量

參照文獻[7]方法：獲取細胞培養上清液，離心去除沉淀，分裝后-20 ℃冷凍保存。建立標準曲線：設標準孔8孔，每孔加入樣品稀釋液100 μL，第一孔加標準品100 μL，混勻后用加樣器吸出100 μL，移至第2孔。如此反復作對倍稀釋至第7孔，最后，從第7孔中吸出100 μL，第8孔為空白對照組；將反應板密封置于22 ℃～25 ℃孵育60 min；洗板后每孔中分別加入第一抗體工作液100 μL；重復孵育及洗板1次；每孔加酶標抗體工作液100 μL；再重復孵育及洗板1次；每孔加入100 μL TMB底物工作液，置于22 ℃～25 ℃孵育15 min；每孔加入100 μL終止液。在5 min內于492 nm處測吸光值。根據標準品光密度值，對應相應稀釋度，以線性回歸方程計算相應培養液細胞因子濃度。

1.4 Western blot檢測NF-κB p65和TLR4蛋白表達

參照文獻[8]方法，提取蛋白樣品，然后加入適量SDS上樣緩沖液和10%β-巰基乙醇，100 ℃煮10 min，10%聚丙烯酰氨凝膠電泳后，轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉4 h，分別加入NF-κB p65(1∶200)、TLR4(1∶1 000)和β-actin(1∶2 000)一抗孵育4～8 h，TBST緩沖液洗滌30 min，換液1次/10 min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌30 min，換液1次/10 min。用Western blot熒光檢測試劑盒顯示于X光片。然后用Labwork凝膠圖像分析系統對膠片進行掃描，以對照組的面積灰度值為100%與實驗組進行半定量分析。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 丹紅注射液抑制脂多糖誘導的炎癥因子釋放

THP-1巨噬細胞與LPS共同孵育后，細胞上清液中促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量明顯升高，再加入丹紅注射液后，可有效抑制LPS誘導的促炎因子釋放(P<0.05)(表1)。

2.2 丹紅注射液抑制核因子NF-κB的核轉位

與對照組比較，LPS組細胞核內NF-κB p65的蛋白表達明顯增加，約為對照組的4倍(P<0.05)；單獨加入丹紅注射液，對NF-κB p65的核轉位無明顯影響；加入LPS和丹紅注射液共處理細胞組，與LPS組比較，細胞核內NF-κB p65的表達明顯下降(P<0.05，圖1)。

表1丹紅注射液對LPS誘導的巨噬細胞炎癥因子釋放的影響(n=3)

分 組TNF?α(pg/mL)IL?6(pg/mL)IL?1β(pg/mL)對照組25．17±3．3243．26±8．1715．36±2．18LPS組168．62±15．78a205．38±23．64a76．41±8．32a丹紅組24．33±6．1838．35±5．1518．38±1．97LPS+丹紅組73．51±9．75b64．48±13．66b39．12±9．05b

與對照組比較，a：P<0.05；與LPS組比較，b：P<0.05

圖1 丹紅注射液對巨噬細胞NF-κB p65核轉位的影響(n=3)A：Western blot檢測NF-κB p65蛋白表達；B：半定量分析圖. 1：對照組；2：LPS組；3：丹紅組；4：LPS+丹紅組. 與對照組比較，*：P<0.05；與LPS組比較，**：P<0.05

2.3 丹紅注射液抑制巨噬細胞TLR4表達

加入LPS后，與對照組比較，巨噬細胞TLR4蛋白的表達明顯增加(P<0.05)；用LPS和丹紅注射液共處理巨噬細胞后，與LPS組比較，TLR4的蛋白表達明顯下降(P<0.05)(圖2)。

圖2 丹紅注射液對巨噬細胞TLR4蛋白表達的影響(n=3)A：Western blot檢測TLR4蛋白表達；B：半定量分析圖. 1：對照組；2：LPS組；3：丹紅組；4：LPS+丹紅組. 與對照組比較，*：P<0.05；與LPS組比較，**：P<0.05

3 討 論

As是一種慢性炎癥性疾病，單核/巨噬細胞參與了As病理進程中的多個環節。巨噬細胞通過清道夫受體如SR-A、CD-36攝取氧化脂質導致泡沫細胞形成，是As斑塊始發與進程中的關鍵環節[9]。巨噬細胞的增殖和凋亡對As斑塊易損性和不穩定性均有很重要的影響。巨噬細胞產生的因子如TNF-α、IL-6和IL-1β，可增強炎癥反應而促進As進程。單核/巨噬細胞自身活動的相關領域以及它們在斑塊部位與其他細胞的相互作用成為動脈粥樣硬化新興的治療靶點[10]。THP-1細胞源性巨噬細胞已廣泛被應用于巨噬細胞相關的多種病理過程和疾病的研究[11]。本研究對其進行研究發現，丹紅注射液處理巨噬細胞后，可明顯抑制LPS所誘導的促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放，說明丹紅注射液的抗As作用很可能與其抑制炎癥的作用有關。

史衛國等[12]研究發現，丹紅注射液對擇期經皮冠狀動脈術后患者的IL-6、纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)等物質的活性有明顯抑制作用；對家兔的研究表明，丹紅注射液可下調體內炎性因子誘導性一氧化氮合酶(iNOS)和環氧合酶-2(COX-2)表達[4]；細胞實驗中，丹紅注射液可降低巨噬細胞上清中趨化因子配體16(CXCL16)、基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達[13]。最新的研究表明，小鼠腹膜內注射LPS(1 mg/kg)建造全身性炎癥反應綜合征(SIRS)模型，然后在用丹紅注射液處理，可明顯減輕小鼠體內IL-6等促炎因子的表達水平[14]。這些結果與本研究結果一致，都說明丹紅注射液具有明確的抗炎效應。

NF-κB是一種具有基因轉錄多項調控作用的轉錄因子，能與靶基因的啟動子或增強子部位的κB位點結合，啟動基因的轉錄。NF-κB參與了炎癥過程中多種信號的轉導途徑并且與As關系密切[15-16]。多種涉及機體炎癥反應的基因，包括TNF-α、IL-6和IL-1β等，在其基因的啟動子和增強子中存在一個或多個κB序列，因此，NF-κB激活往往是這些基因活化的前提[17]。本研究發現，丹紅注射液處理細胞后，與LPS組比較，核內NF-κB p65的表達明顯下降，說明丹紅注射液能有效抑制NF-κB的激活，進而下調巨噬細胞促炎因子的釋放。

Toll樣受體(TLRs)是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質分子，Toll樣受體4(TLR4)是對LPS敏感的TLRs家族成員之一，研究表明As斑塊中TLR4的表達明顯上調，且主要表達在巨噬細胞，被認為是與人類As關系最為密切的Toll樣受體之一[18]。LPS主要是通過識別細胞膜上TLR4受體，進而通過經典途徑、旁路途徑和非典型途徑激活NF-κB，引起多種促炎相關基因表達的變化[19]。本研究選擇TLR4做為觀察指標，進一步探討丹紅注射液抑制NF-κB活化及促炎因子分泌的原因，結果發現，丹紅注射液能有效抑制LPS所誘導的巨噬細胞TLR4表達，說明丹紅注射液是通過調節TLR4-NF-κB途徑發揮其抗炎作用的。

總之，本研究研究發現丹紅注射液能有效抑制巨噬細胞促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌，其作用機制與丹紅注射液調控TLR4-NF-κB信號途徑有關。丹紅注射液也有降低血脂和調節體內應激水平的作用[4]，這些發現都為丹紅注射液在臨床As性疾病的臨床應用提供了一定的理論依據。深入探討丹紅注射液的抗炎機制，有助于進一步發現治療炎癥相關性疾病的新策略。

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EffectandMechanismsofDanhongInjectiononProinflammatoryCytokinesReleasefromTHP-1MacrophagesInducedbyLipopolysaccharides

ZENG Haiyan，FANG Yong，ZENG Gaofeng
(DepartmentofCardiovascularMedicine，theSecondAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina，Hengyang,Hunan421001，China)

ObjectiveThis study was to investigate the effect of Danhong injection on proinflammatory cytokine release from lipopolysaccharide (LPS)-induced THP-1 macrophages.MethodsHuman THP-1 macrophages were induced using phorbol-12-myristate acetate (PMA，160 nmol/L) for 24 h，then cells were divided into four groups:control group，LPS group，Danhong group and LPS+Danhong group.Secretion of proinflammatory cytokines，including tumor necrosis factor-α (TNF-α)，interleukin-6 (IL-6) and interleukin-1β (IL-1β) was performed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The protein expression of nuclear factor-κB (NF-κB) p65 and Toll-like receptor 4 (TLR4) were examined by Western blot.ResultsDanhong injection inhibited the release of TNF-α，IL-6 and IL-1β induced by LPS，repressed the translocation of NF-κB to the nucleus and TLR4 expression.ConclusionsDanhong injection inhibited the release of inflammatory cytokine that induced by LPS，and the mechanisms may be related to the TLR4 and NF-κB expressions.

Danhong injection; proinflammatory cytokines; nuclear factor-κB; Toll-like receptor 4; atherosclerosis

2095-1116(2014)05-0443-04

2014-03-20

衡陽市科技局項目資助(2103K159).

曾海燕，碩士，主治醫師,研究方向：心血管疾病的臨床診療和動脈粥樣硬化性疾病發病機制及防治，E-mail:18973468460@189.cn.通訊作者曾高峰，博士，主任醫師，研究方向：心血管內科疾病的診治和介入心臟病學研究，E-mail:qichingnudou@tom.com.

R363.1

A

(此文編輯：朱雯霞)