響應面優化超聲輔助提取虎眼萬年青多糖工藝

李海平，陳瑞戰，金辰光，劉小娜

虎眼萬年青(俗稱葫蘆蘭)，為多年生草本植物，原產于非洲南部。20世紀70年代，虎眼萬年青以一種觀賞植物被引進中國，并在海南、西安、長白山等地區試栽［1］。大量研究發現，虎眼萬年青多糖及配糖體通過非特異性免疫、體液免疫和細胞免疫，對機體具有顯著的免疫增強和調節作用，有抗氧化、抗衰老、抗病毒和抗腫瘤等藥理活性［2－3］?；⒀廴f年青多糖常用的提取方法是熱回流提取，該方法具有時間長、溫度高、能耗高、提取率較低等缺點，且過高的溫度、較長的提取時間易引起多糖的結構變化［4］。超聲波是指頻率為2×104～2×109Hz的聲波。超聲提取是通過一定頻率的大量超聲波作用于提取液時，溶液中尺寸適宜的小泡產生共振，小泡隨聲波的變化而迅速脹大和壓縮，從而產生高壓沖擊波。這種強烈的沖擊作用能使超聲提取方法大幅度地提高有效成分的提取率［5］，但過強的超聲功率、較高超聲溫度也可能引起多糖結構變化和活性的降低。因此，本研究在單因素試驗的基礎上，采用超聲波提取虎眼萬年青多糖并用響應面法對提取工藝進行了優化，以縮短時間、提高提取率、降低能量消耗，為高活性多糖的生產提供一種高效的提取工藝，為多糖的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

虎眼萬年(青鱗莖)由長春應用化學研究所化學生物學實驗室提供?；瘜W試劑均為國產分析純。

SL－2010N多頻超聲波細胞粉碎儀(南京順流儀器有限公司);UV－2401紫外－可見分光光度計(日本島津公司);DZ－2BCII真空干燥箱 (天津泰斯特);RV10旋轉蒸發儀 (德國IKA公司);GSY－11型恒溫水浴箱(北京市醫療設備廠);FD－1－50冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司);TDL－40B離心機(上海安亭科學儀器廠);SHB－B88循環水式多用真空泵(菏澤市生化儀器廠)。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理

虎眼萬年青鱗莖真空干燥24h，粉碎成粉末，用石油醚回流脫脂、脫色兩次，每次2h，抽濾，濾渣揮干溶劑備用。

1.2.2 多糖超聲提取

準確稱取預處理樣品5g于提取瓶中，加入蒸餾水150mL，浸泡6h，用多頻超聲波細胞粉碎儀，在提取時間(10～50min)、溫度(40～80℃)、超聲功率(600～1200W)條件下超聲提取;提取液濃縮至一定體積，加入乙醇至最終為75%(乙醇)，在4℃溫度下沉化36h，減壓過濾，沉淀用蒸餾水溶解，除去游離蛋白質，用蒸餾水透析48h，除去寡糖、單糖、無機鹽等小分子，凍干得粗多糖，用苯酚－硫酸法測量多糖含量［6］，計算出提取得率。提取得率(%)=(虎眼萬年青多糖質量/虎眼萬年青原料質量)×100%。

1.2.3 多糖含量測定

精密稱取葡萄糖標準品1g，溶解后定容成50mL，然后稀釋成0.25mg·mL－1標準液。準確量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL 葡萄糖標準液于15mL 比色管中，加蒸餾水至 2.0mL，再分別加入 5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，加入濃H2SO45mL，置于沸水浴中加熱20min，取出冷卻至室溫，在490nm波長下，以試劑空白(2mL蒸餾水代替葡萄糖溶液)為參比，測定吸光值。得線性回歸方程為:

A=5.3417C+0.4727， 相關系數 R2=0.9948，

式中，A為吸光度;C為測定液濃度(mg·mL－1)。

1.2.4 單因素試驗

以多糖提取得率為指標，分別考察超聲時間 (10、20、30、40、50min)、提取溫度 (40、50、60、70、80℃)、超聲功率 (600、750、900、1050、1200W)和溶劑原料比(20、30、40、50、60mL·g－1)對虎眼萬年青多糖提取得率的影響。

1.2.5 提取工藝響應面法優化

在單因素試驗基礎上，采用Box－Benhnken Design試驗設計方案，以超聲時間 (X1)、提取溫度 (X2)、超聲功率(X3)和溶劑原料比(X4)為考察變量，以虎眼萬年青粗多糖提取得率 (Y)為響應值，應用Design－Expert 6.0軟件，建立數學回歸模型，確定最佳超聲輔助提取工藝參數。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 超聲時間對多糖提取得率的影響

固定溶劑原料比30mL·g－1、提取溫度60℃、超聲功率1050W，考察超聲時間10、20、30、40、50min對提取得率的影響，結果如圖1(a)所示。由圖1(a)可看出，超聲時間在30min內，多糖提取得率會隨時間的延長而增大;但超聲時間超過30min后，提取得率有所降低。由于超聲波可以提高水分子滲透到固體組織內部和細胞內多糖在水中溶解以及向周圍溶劑擴散的速率，在較短的時間內多糖從細胞內擴散到外部的水中。但是，較長的超聲時間可能會導致部分多糖的分解，多糖的提取率會隨超聲時間的延長而降低。有學者認為這部分多糖可能分解成一些游離的小分子糖［7］。因此，超聲提取最佳時間選擇30min較為合適。

2.1.2 超聲溫度對多糖提取得率的影響

固定溶劑原料比30mL·g－1、超聲時間30min、超聲功率 1050W，考察超聲溫度 40、50、60、70、80℃對提取得率的影響，結果如圖1(b)所示。由圖1(b)可看出，在40～60℃溫度范圍內，多糖提取得率隨溫度的增加而增加;但超過60℃后，多糖提取得率隨溫度增加而降低。說明在一定的提取溫度范圍內，多糖的溶解度會隨著溫度的升高而增大，提取得率增加;但提取溫度升高達到一定程度時，可能會引起部分多糖水解為單糖或低聚糖，從而導致多糖的提取率下降。所以，采用超聲輔助提取虎眼萬年青多糖時，選用60℃左右的溫度比較適宜。

2.1.3 超聲功率對多糖提取得率的影響

固定溶劑原料比30mL·g－1、提取溫度60℃、超聲時間 30min，考察超聲提取功率600、750、900、1050、1200W對提取得率的影響，結果如圖1(c)所示。由圖1(c)可以看到，超聲功率在600～1050W內，多糖得率隨超聲功率的增加而增加;但功率超過1050W時，多糖得率隨功率增加反而開始降低。據文獻報道，超聲波具有無選擇性的破壞作用。在高功率下，超聲空化作用強，不僅能破壞細胞壁，也能破壞欲提取物質的分子結構，造成提取率下降［8］;而且對于多糖來說，超聲作用效果與超聲功率、多糖的結構與活性有關。所以，超聲頻率選用1050W較為適宜。

2.1.4 溶劑原料比對多糖提取率的影響

超聲時間 30min、提取溫度60℃、超聲功率 1050W，考察溶劑原料比20、30、40、50、60mL·g－1對多糖提取得率的影響，結果如圖1(d)顯示。圖1(d)顯示，多糖提取得率隨溶劑原料比的增大而增加，當溶劑原料比高于40mL·g－1時，多糖提取率開始下降。原因可能是溶劑原料比過低會導致多糖的溶解不充分，也不利于細胞內多糖向周圍提取溶劑的擴散;當溶劑原料比過大時，在超聲功率和超聲時間一定的條件下，單位體積的提取溶劑吸收的超聲能量會大幅降低，超聲波引起的空化、機械、熱效應也會降低，最終導致多糖的提取得率下降。所以，溶劑原料比選擇為40mL·g－1。

圖1 單因素對提取得率的影響

2.2 響應面設計試驗結果

2.2.1 Box－Behnken設計方案

在單因素試驗的基礎上，選擇超聲時間(X1)、提取溫度(X2)、超聲功率(X3)以及溶劑原料比(X4)4個因素，每個因素取3個水平，以虎眼萬年青粗多糖提取得率(Y)為響應值進行響應面優化。根據 Box－Behnken的中心組合試驗設計原理設計試驗方案［9］，試驗因素和水平設計見表1，試驗結果見表2。

表1 試驗因素水平及編碼

表2 Box－Behnken試驗設計方案及結果

2.2.2 回歸方程的構建和方差分析

通過SAS數據分析軟件對表2中的響應面試驗結果進行回歸分析。以虎眼萬年青粗多糖的提取得率(Y)為因變量，超聲時間(X1)、提取溫度(X2)、超聲功率(X3)以及溶劑原料比(X4)為自變量，進行回歸擬合，得到回歸方程:

對上述回歸模型進行F檢驗，判定回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性。概率越小，則相應變量的顯著程度越高。方差分析結果見表3。

表3 響應面回歸模型的方差分析結果

由表3可看出，模型Pr＞F值＜0.0001，說明該模型極顯著，不同因素間的差異顯著，證明該回歸模型能夠較好地預測試驗結果。模型的復相關系數R2為0.9127，說明響應值的變化有91.27%來源于所選因變量的變化，說明模型試驗誤差小，擬合程度良好。在所選因素和水平范圍內，對響應值的影響次序為:提取溫度二次方項(X22)＞超聲功率二次方項()＞溶劑原料比的一次項(X4)＞溶劑原料比的二次方項)＞提取溫度的一次項(X2)＞超聲時間二次方項(X12)＞超聲功率的一次項(X3)＞超聲時間的一次項(X1)＞超聲時間和提取溫度的交互項(X1X2)。其它因素對響應值的影響不顯著(p＞0.05)。

2.2.3 響應面分析

超聲提取過程中，超聲時間、提取溫度、超聲功率以及溶劑原料比對提取得率影響的三維響應曲面如圖2所示。固定超聲功率1050W、溶劑原料比40 mL·g－1，超聲時間和提取溫度對提取得率的交互影響的響應曲面如圖2(a)所示，在20～35min超聲時間內延長超聲時間有利于多糖的提取，當超聲時間超過35min后隨時間增加提取得率緩慢降低，發生這一現象的可能原因是長的超聲時間(較高的溫度)導致多糖的降解［10］。在50～65.8℃范圍內，隨溫度的增加提取得率快速增加;提取溫度超過65.8℃時，隨溫度的增加提取得率快速降低，發生這一現象的原因除了在較高的溫度和較強的超聲波作用多糖可能降解之外，另一方面是隨溫度的升高，超聲波的空化效應降低，從而導致提取得率降低［11］。綜合看來，相對較長的超聲時間和較高的提取溫度對增加提取得率是有利的，提取溫度較超聲時間對提取得率的影響相對較大。

超聲時間與超聲功率對提取得率的交互影響的響應曲面如圖2(b)所示。由圖2(b)可以看到，超聲時間和超聲功率的等值線圖呈現顯著的橢圓形，說明二者的交互作用相對較強。在超聲時間20～33.5min和超聲功率900～1100W范圍內，提取得率隨超聲時間和功率的增加而增加;之后隨超聲時間和超聲功率的增加，提取得率逐漸降低。說明在較強的超聲功率作用下，在短的超聲時間內多糖的溶解和擴散即可達到平衡，而過高的超聲功率和長的超聲時間共同的作用結果會導致提取得率的降低。超聲功率相對較超聲時間對提取得率的影響較大。

圖2 三維響應曲面圖

超聲時間與溶劑原料比對提取得率的交互影響的響應曲面如圖2(c)所示。由圖2(c)可以看到，在超聲時間20～30min和溶劑原料比30～41.5mL·g－1范圍內，提取得率隨超聲時間和溶劑原料比的增加逐漸增加;之后隨超聲時間和溶劑料液比的增加緩慢降低。表明在一定的范圍內增加超聲時間和溶劑原料液比都有利于提取得率的增加，但過分增加會導致提取得率的降低，適宜的超聲時間和溶劑原料比對虎眼萬年青多糖的提取是十分必要的。綜合分析可以看到超聲時間和溶劑原料比對提取得率的影響相對較小。

提取溫度與超聲功率對提取得率的交互影響的響應曲面如圖2(d)所示。由圖2(d)可以看出，在50～62℃和900～1060W的范圍內，提取得率隨溫度和超聲功率的增加快速增加，超過這一范圍后逐漸降低。說明在一定的范圍內增加超聲功率和提取溫度都有利于提取得率的增加，但過高的提取溫度和超聲功率共同作用的結果會導致多糖的降解、提取得率的降低，所以應選擇適應的超聲功率和提取溫度。從圖形分析看，溫度對提取得率的影響高于超聲功率。

提取溫度與溶劑原料比對提取得率的交互影響的響應曲面如圖2(e)所示。由圖2(e)可以看出，在50～62.5℃和30～43mL·g－1的范圍內，提取得率隨提取溫度和溶劑原料比的增加逐漸增加，之后會隨二者增加而逐漸降低，原因是在一定范圍內增加溶劑原料比和提高溫度，都利于多糖的溶解和擴散，增加提取得率;但溶劑原料比過大時，超聲波能量會被溶劑緩釋，作用效果降低，造成多糖的提取得率下降。

超聲功率與溶劑原料比對提取得率的交互影響的響應曲面如圖2(f)所示。在900～1100W和30～45mL·g－1范圍內，多糖提取得率隨超聲功率和溶劑原料比的增加而逐漸增加;之后又會隨著超聲功率和溶劑原料比的增加而降低。說明在超聲功率過大時，提取物的分子結構也會被破壞;而溶劑原料比過大時，超聲波輻射能會被溶劑緩釋，使多糖提取率降低。

2.2.4 最優提取工藝的確定

通過對響應曲面圖以及利用Design－Expert 6.0的軟件對實驗數據進行優化分析，確定了超聲輔助提取虎眼萬年青多糖的最優提取條件:超聲時間30.05min、提取溫度59.47℃、超聲功率1059.15W、溶劑原料比40.11mL·g－1，該條件下虎眼萬年青多糖理論提取得率為50.12%?？紤]到試驗的可操作性，把上述優化提取條件修正為超聲時間30min、提取溫度60℃、超聲功率1050W、溶劑原料比40mL·g－1，重復5次進行驗證試驗，得到虎眼萬年青粗多糖平均提取得率為50.06%，相對預測值的誤差0.06%，相對誤差小于1%，驗證了模型的可行性。所以，應用響應面法優化超聲輔助提取虎眼萬年青多糖獲得的工藝參數是可靠的，具有一定的實用價值。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，通過Box－Behnken試驗設計、響應面分析，建立了超聲提取虎眼萬年青多糖的回歸模型;經過方差分析建立的模型與實際實驗擬合較好，試驗誤差較小，可以用于提取得率的預測分析;通過響應面分析優化出最佳提取條件:超聲時間30.05min、提取溫度59.47℃、超聲功率1059.15W、溶劑原料比40mL·g－1。按此工藝條件，虎眼萬年青多糖實驗提取得率接近于模型的預測得率，說明優化得到的條件可靠，該模型具有較高的準確性和實用性。本研究為植物多糖的生產供了一種有效的方法，為多糖的開發與利用提供了理論依據。

［1］徐暾海，徐雅娟，劉大有，等.虎眼萬年青化學成分［J］.藥學學報，2000，35(1):32－36.

［2］Chen，R Z.，Li，Y.，Dong，H.，et al.Optimization of ultrasonic extraction process of pol ysaccharides from Ornithogalum Caudatum Ait and evaluation of its biological activities［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2012，19(6):1160－1168.

［3］蔡艷，李元，董航，等.正交實驗優化虎眼萬年青多糖提取工藝及抗氧化活性評價［J］.長春師范學院學報:自然科學版，2012，31(3):75－80.

［4］Wang，Q H.，Sun，Y P.，Yang，B Y.，et al.Optimization of polysaccharides extraction from seeds of Pharbitis niland its anti－oxidant activity［J］.Carbohydrate Polymers，2014，102:460－466.

［5］張柱，趙國群.超聲波萃取植物多糖的研究［J］.食品科學，2005，26(9):302－305.

［6］Cuesta，G.，Suarez，N.，Bessio，M I.，et al.Quantitative determination of pneumococcal capsular polysaccharide serotype 14 using a modification of phenol－sulfuric acid method［J］.Journal of Microbiological Methods，2003，52(1):69－73.

［7］Li，J W.，Ding，SD.，Ding，X L.Optimization of the ultrasonically assisted extraction of polysaccharides from Zizyphus jujuba cv.Jinsixiaozao［J］.Journal of Food Engineering，2007，80(1):176－183.

［8］Yang，B.，Zhao，M.，Shi，J.，et al.Effect of ultrasonic treatment on the recovery and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from longan fruit pericarp［J］.Food Chemistry，2008，106(2):685－690.

［9］Ying，Z.，Han，X.，Li，J.Ultrasound－assisted extraction of polysaccharides from mulberry leaves［J］.Food Chemistry，2011，127(3):1273－1279.

［10］Chandrika，L.P.，Fereidoon，S.Optimization of extraction of phenolic compounds from wheat using response surface methodology［J］.Food Chemistry，2005，93(1):47－56.

［11］Zhao，SN.，Kwok，K C.，Liang，H H.Investigation on ultrasound assisted extraction of saikosaponins from Radix Bupleuri［J］.Separation and Purification Technology，2007，55(3):307－312.