組織工程骨表面微觀形貌和生物礦化的實驗研究

寧寅寬，李 強，蔡偉良，武成聰，陳佳濱，石正松

組織工程骨表面微觀形貌和生物礦化的實驗研究

寧寅寬，李 強，蔡偉良，武成聰，陳佳濱，石正松

目的用綠色熒光蛋白（GFP）標記結合掃描電鏡和X射線能譜分析（SEM／EDS）技術對組織工程骨的表面微觀形貌和生物礦化進行觀測，以評價脫鈣骨（DBM）支架體外構建組織工程骨的生物性能。方法用重組腺病毒介導GFP基因轉染兔骨髓間充質干細胞（BMSCs）進行示蹤標記，細胞與DBM復合經成骨誘導后，通過倒置熒光顯微鏡對細胞生長情況進行即時觀察，結合SEM／EDS技術，觀測組織工程骨的表面微觀形貌和生物礦化。結果在倒置熒光顯微鏡下見細胞在DBM支架上能較好的黏附、重疊生長和增殖，體外培養至14 d時，細胞內GFP有較高水平瞬時表達。SEM見DBM呈疏松多孔結構，孔隙直徑為300～600 μm，孔隙率達90%。SEM下觀察組織工程骨，見細胞在DBM網孔內表面貼壁生長，分泌基質旺盛，并可見粗糙的生物礦化物覆蓋支架。EDS顯示其表面為鈣、磷沉積物，其鈣磷比（Ca／P）為1.46。結論 DBM體外構建組織工程骨有非常好的生物性能，GFP標記結合SEM／EDS技術可以作為DBM體外構建組織工程骨較好的評價手段。

重組腺病毒；綠色熒光蛋白；骨髓間充質干細胞；脫鈣骨基質；能譜分析

骨組織工程概念的提出為骨組織缺損的再生修復提供新的治療手段，種子細胞、支架材料和生長因子是骨組織工程的3大要素，也是組織工程骨移植到體內發揮功能的重要因素［1］。松質骨經過脫脂、脫鈣等處理后，內含有骨形態形成蛋白生長因子［2］，與骨髓間充質干細胞（bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）復合可體外構建組織工程骨。但是在構建組織工程骨及對其生物活性進行深入研究時，對BMSCs在支架上的黏附、分布和生長情況無較理想的即時觀測方法［3］，對脫鈣骨（demineralized bone matrix，DBM）體外構建組織工程骨的表面礦化研究，國內外也鮮有報道。該實驗用重組腺病毒介導綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因轉染兔BMSCs進行示蹤標記，結合掃描電鏡和X射線能譜分析（scanning electron microscope and energy dispersive spectrometer，SEM／EDS）技術，觀測組織工程骨的微觀形貌和生物礦化，以評價DBM體外構建組織工程骨的生物性能，為后期組織工程骨體內植入實驗奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1腺病毒載體 Ad-GFP表達載體由美國英濰捷基（上海）貿易有限公司構建、鑒定和提供。采用免疫法檢測腺病毒滴度，病毒滴度為2×1010pfu／ml。

1.1.2兔BMSCs制備 本課題組前期實驗已完成了兔BMSCs的獲取、培養及鑒定，并取第5代細胞加入凍存保護液，程序降溫后液氮保存備用［4］。本次實驗細胞為第5代凍存細胞復蘇后傳代至第10代的BMSCs。

1.1.3實驗動物 健康雄性新西蘭大白兔1只，6月齡，3.2 kg，清潔級，購于桂林醫學院動物實驗中心，實驗過程中對動物的處置符合醫學倫理學標準。

1.1.4主要儀器和試劑 低糖DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清（美國Hyclone公司）；維生素C、β-磷酸甘油、地塞米松（韓國BIOSHARP公司）；脫鈣液（濃鹽酸15 ml、氯化鈉175 g、蒸餾水1 000 ml）、戊二醛（美國Sigma公司）；CO2細胞培養箱（美國Thermo Scientifc公司）；生物安全柜（中國蘇凈安泰公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；場發射SEM（荷蘭飛利浦公司）；EDS儀（英國牛津公司）。

1.2 方法

1.2.1 DBM制備參考文獻［5］方法制作DBM基質。將健康雄性新西蘭大白兔麻醉后處死，取四肢骨干骺端、椎體及髂骨松質骨，－80℃冰箱凍存3 d。除去附著肌肉和骨膜，放入脫鈣液中脫鈣3 d。再將骨塊置于乙醚、無水乙醇中脫脂各1 d，以無菌蒸餾水反復沖洗、浸泡，至浸泡液呈中性。脫鈣松質骨自然晾干，剪成大小約2 mm×3 mm×5 mm塊狀，環氧乙烷消毒，4℃保存備用。

1.2.2兔BMSCs的復蘇、傳代培養及轉染 將待復蘇的兔BMSCs凍存管迅速解凍，轉移至含有3倍于凍存保護液體積的L-DMEM離心管中1 500 r／min離心5 min，棄上清液。細胞沉淀中加入5 ml完全培養基，充分吹打細胞懸液至細胞分布均勻，以含15%血清的L-DMEM完全培養基（含100 IU／ml青霉素、100 IU／ml鏈霉素）接種于25 cm2塑料培養瓶，置于37℃、5%CO2飽和濕度環境中培養，細胞復蘇24 h后換液。各代BMSCs體外培養至單層細胞匯合約80%，用0.25%胰蛋白酶消化，行1∶2～3傳代培養，細胞傳至第10代細胞進行實驗。設置轉染復數（MOI＝100），用重組腺病毒Ad-GFP轉染細胞，轉染24 h后換液。

1.2.3轉染后兔BMSCs與DBM復合構建組織工程骨 將轉染后的細胞重懸，用細胞計數板計數每個25 cm2塑料培養瓶細胞數目，收集1×108個數量細胞。用離心機低速離心（1 500 r／min，5 min）后，棄上清液，用1 ml完全培養基再次重懸細胞，以調整細胞密度為1×107個／ml，與DBM基質復合，次日更換骨誘導培養液（含10 nmol／L地塞米松、15 mmol／L維生素C、10 mmol／L β-磷酸甘油、pH＝7.3），孵育1周后，更換完全培養基培養。在倒置熒光顯微鏡下逐日觀察細胞在DBM上的黏附、分布和增殖情況。

1.2.4DBM和組織工程骨在SEM下的表面微觀形貌及EDS分析 將構建的組織工程骨在體外培養2周后，用2.5%戊二醛固定，梯度丙酮脫水，并與DBM同時真空干燥，噴金鍍膜，在Quanta 200 FEG場發射環境SEM和EDS儀上進行測試。在SEM下觀察DBM和構建的組織工程骨表面微觀形貌，應用計算機圖像處理系統計算DBM的孔徑和孔隙率。隨機獲取檢測微區，用EDS儀測定微區主要元素（C、O、Ca、P）的重量百分比和原子百分比百分含量，重復3次。EDS技術指標：電壓10 kV，電子束6.0，工作距離為9.0 mm。

2 結果

2.1 組織工程骨在倒置熒光顯微鏡下的觀察參考本課題組前期實驗方法［5］，測定細胞黏附率為71%。細胞黏附DBM后，在倒置熒光顯微鏡下選擇同一部位觀察，在不激發藍光的情況下，見不透光的脫鈣骨支架，支架邊緣較薄處，顯微鏡微調下可見三維孔隙結構。藍光激發后，熒光顯微鏡下能觀察到綠色熒光，呈滿天星樣，細胞在DBM支架上能較好的黏附、重疊生長和增殖，細胞內GFP有較高水平瞬時表達。見圖1。并隨著培養時間的延長，綠色熒光逐漸增強，培養至14 d到最亮強度，培養至21 d后，熒光逐漸減弱至消失。

2.2 DBM和組織工程骨在SEM下的觀察及EDS分析SEM下，DBM表面粗糙，呈疏松多孔結構，孔徑大小不等，形狀不規則且相互交通；其孔隙直徑為300～600 μm，平均為360 μm，孔隙率達90%，見圖2。組織工程骨在SEM下觀察，可見細胞在DBM網孔內表面黏附、伸展良好，貼壁生長，呈成纖維細胞形態，疊瓦狀分布，并可見細胞基質分泌旺盛，幾乎充滿支架孔隙。見圖3。體外培養14 d后的組織工程骨在SEM下可粗糙的生物礦化物覆蓋。用EDS儀檢測DBM和組織工程骨分別得出分析圖譜。見圖4。同時計算機由譜峰強度自動換算為所測主要元素的相對含量。見表1。數據顯示組織工程骨體外培養14 d后，表面鈣元素含量較DBM約高3.38倍，磷元素重量百分比從無增加到0.43。組織工程骨鈣磷比（Ca／P）為1.46，接近羥基磷灰石鈣磷比1.67，說明其表面有鈣、磷沉積物產生，可能為磷酸鈣鹽。

表1 DBM和組織工程骨表面元素分析

3 討論

SEM／EDS在觀測樣品表面微觀形貌的同時還能進行微觀元素分析，了解樣品微觀結構變化與其元素組成變化的關系；這是一種高度靈敏的超微量表面分析技術，國內外大量學者已將其運用于生物礦化材料領域研究［6］。EDS是目前常用的分析物質成分的方法。當能量大于原子電離臨界激發能量的入射電子打到樣品上時，能將原子電離，激發出特征性的X射線。一種元素發射出的特征性X射線強度與該元素在樣品中的含量呈正比例關系，因此利用EDS儀測量出樣品中各種特征性X射線的強度，再利用定量模型計算出元素的絕對含量或相對含量，可了解一種新物質的基本成分及其理化性質［7］。但EDS技術的應用仍有局限性，是對樣品表面元素相對含量的分析，如相對質量、相對原子個數，無法完全代表絕對含量變化［8］。本實驗初步嘗試將SEM／EDS技術應用于以DBM為支架材料體外構建組織工程骨研究，觀測其表面微觀形貌和生物礦化。

生物礦化作用是在生物有機物質的控制或影響下，將溶液中的離子轉變為固相礦物的作用［9］。細胞是礦化的主角［10］。本實驗將兔BMSCs與DBM復合后經成骨誘導液誘導培養14 d后，在SEM下觀察到粗糙的生物礦化物覆蓋。通過EDS儀測量鈣、磷元素顯示，其表面為鈣、磷沉積物，鈣磷比（Ca／P）接近羥基磷灰石鈣磷比，說明沉積物可能為磷酸鈣鹽，提示這是組織工程骨表面礦化沉積的結果。組織工程骨礦化形成過程可能與兔BMSCs體外經成骨誘導后其成骨分化標志物堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型膠原蛋白、鈣結節形成有關。成骨細胞高表達ALP，促進骨間質礦化，其分泌的Ⅰ型膠原蛋白是構成骨組織的蛋白支架，對骨的礦化起重要作用。分泌的膠原纖維與鈣鹽親和，形成鈣結節，促進鈣鹽沉積［11］。骨組織的礦化過程實質上就是磷酸鈣鹽在骨組織內沉積的積累過程，整個骨組織礦化過程始終伴隨著鈣、磷等元素的變化。

DBM經過脫脂、脫鈣等處理后，具有天然的立體孔隙結構，同時DBM內含有骨形態形成蛋白，使其具有骨誘導性［12］。本課題組在前期體外實驗［5］觀察DBM的降解性能、孔隙率以及BMSCs和DBM的黏附性，證實DBM的降解曲線和BMSCs的增殖曲線相一致，具備良好的孔隙率和黏附率，提示DBM可成為比較理想的生物支架材料。在本實驗中，制備的DBM在SEM下有較好的三維孔隙結構，孔隙直徑為300～600 μm，孔隙率達90%；EDS顯示DBM保留了適當含量的鈣離子，可作為新生骨再鈣化的核心，為磷酸鈣的礦化沉積提供晶核。SEM和GFP標記顯示細胞在DBM支架上黏附、伸展良好。但是DBM作為骨組織工程支架材料仍存不足之處，如機械強度差、降解快、供受體差異的缺點，以及DBM的制備方法等因素都可能影響DBM的質量，使其應用受到限制［13］。

GFP基因標記是一種細胞示蹤技術，可觀察細胞在體外支架上的形態和分布［14］。重組腺病毒是一種安全、高效的基因載體，能夠高水平瞬時表達外源基因，克隆的細胞不表達目的基因［15］。本實驗用成骨誘導液誘導兔BMSCs向成骨方向分化和增殖，使細胞能在DBM有限的三維空間內重疊生長，不發生接觸抑制。GFP標記顯示細胞在DBM支架上能較好地黏附、重疊生長和增殖。組織工程骨在體外培養至14 d時，綠色熒光最亮，說明細胞內GFP仍有較高水平瞬時表達。培養至21 d后，熒光逐漸減弱至消失，可能是GFP表達減弱和細胞大量增殖、重疊生長的共同結果。因此，應用外源基因轉染細胞體外構建組織工程骨時，需要在目的基因較高水平瞬時表達之前植入體內，才能發揮其生物學功能。

綜上所述，DBM體外構建組織工程骨有非常好的生物性能。其次，利用GFP標記結合SEM／EDS技術觀測組織工程骨的體外構建，評價支架材料體的生物性能，以利于篩選更好的支架，為體外構建組織工程骨積累實驗依據。

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Experimental study on surface microscopic morphology and biological mineralization of tissue engineering bone

Ning Yinkuan，Li Qiang，Cai Weiliang，et al
（Dept of Limb Trauma Surgery，The Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001）

ObjectiveGreen fluorescent protein（GFP）labeling，scanning electron microscope and energy dispersive spectrometer（SEM／EDS）were applied to observe surface microstructure and biological mineralization of tissue engineering bone for the purpose of evaluating the decalcified bone matrix（DBM）scaffold materials of biological properties in tissue engineering bone.MethodsThe rabbit bone-marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）were marked by Ad-GFP.Real-time growth of the cells was observed by an inverted fluorescence microscope after the osteoinductive culture on to DBM，and surface microstructure and biological mineralization of tissue engineering bone were observed by SEM／EDS.ResultsThe cells on surface of DBM had a good adhesion，overlap growth，as observed by an inverted fluorescence microscope，and a higher level of transient expression of GFP was confirmed after 14 days in vitro culture.SEM image showed that DBM had a porous structure，with pore diameter ranging from 300 to 600 μm，and a porosity rate was around 90%.The tissue engineering bone showed that cells grew adherently on the surface of DBM，matrix secretion was strong，and the DBM was covered by rough biological mineralization.X-ray photoelectron spectroscopy showed that the surface of rough biological mineralization consisted of Calcium，Phosphorus sediment，and its Calcium and Phosphorus ratio（Ca／P）was 1.46.ConclusionTissue engineering bone constructed by DBM scaffold materials in vitro has excellent biological properties，and combined application of GFP labeling，SEM and X-ray photoelectron spectroscopy is a feasible method for evaluating DBM scaffold material in tissue engineering bone.

adenovirus；green fluorescent protein；bone-marrow mesenchymal stem cells；decalcified bone matrix；X-ray photoelectron spectroscopy

R 687.34

1000－1492（2015）02－0168－05

2014－09－30接收

國家自然科學基金資助項目（編號：31160199）

桂林醫學院附屬醫院四肢創傷手外科，桂林 541001

寧寅寬，男，碩士研究生；李 強，男，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：li.q12251970＠163.com