中藥丹參對哮喘大鼠氣道重塑及基質金屬蛋白酶-9的影響

李玉卿 趙文娟 夏永輝 李彥 陳靜

云南中醫學院，云南昆明650500

中藥丹參對哮喘大鼠氣道重塑及基質金屬蛋白酶-9的影響

李玉卿 趙文娟 夏永輝 李彥 陳靜

云南中醫學院，云南昆明650500

目的研究丹參對哮喘大鼠氣道重塑和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）含量的影響。方法將SPF級SD成年雄性大鼠70只隨機分為正常對照組、哮喘模型組（哮喘2周組、哮喘4周組、哮喘8周組）、丹參干預組（丹參2周組、丹參4周組、丹參8周組）3個大組和7個小組。卵蛋白（OVA）-氫氧化鋁混懸液致敏激發大鼠復制哮喘氣道重塑模型，分別持續2、4、8周。觀察哮喘大鼠肺組織病理形態變化，采用ELISA檢測大鼠肺組織MMP-9含量。結果丹參能改善哮喘大鼠氣道炎癥細胞的浸潤及支氣管平滑肌的增厚。與正常對照組[（1.99±0.29）ng/mL]比較，哮喘4周組[（2.43±0.40）ng/mL]、哮喘8周組[（3.01±0.31）ng/mL]肺組織中MMP-9含量升高（P＜0.05、P＜0.01）；與哮喘2周組[（2.29±0.51）ng/mL]、哮喘4周組[（2.43±0.40）ng/mL]比較，哮喘8周組[（3.01±0.31）ng/mL]肺組織中MMP-9含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與哮喘8周組[（3.01±0.31）ng/mL]比較，丹參8周組[（2.10± 0.20）ng/mL]肺組織中MMP-9含量顯著降低（P＜0.01）。結論丹參能夠抑制哮喘大鼠肺組織MMP-9的分泌，改善哮喘大鼠氣道重塑狀態。

丹參；哮喘；氣道重塑；基質金屬蛋白酶-9

支氣管哮喘（以下簡稱“哮喘”）是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。慢性炎癥導致患者氣道反應性增加，隨病程延長導致氣道不可逆狹窄和氣道重塑。氣道重塑是哮喘的一大重要病理學特征，其本質是氣道纖維化和膠原沉積。氣道重塑可加重氣道高反應性，導致肺功能持續性、進行性損害，從而增加臨床上哮喘的難治性[1]。

大量實驗證實，活血化瘀中藥可治療和控制哮喘氣道炎癥及氣道重塑。丹參是我國傳統醫藥學中應用最早而且最廣泛的活血化瘀藥物之一，具有降低毛細血管通透性、改善微循環、保護肺功能、抗氧自由基、抗炎等作用[2]。近來也有實驗表明，丹參可用于治療哮喘。

基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）是降解細胞外基質（ECM）的主要成分，實驗證實，MMP-9在哮喘小鼠肺組織的表達水平明顯升高，在生理和病理情況下有利于組織重構[3]。MMP-9可作為一種顯示氣道組織破壞與修復情況的標志[4-5]。

本實驗通過組織病理分析和酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測哮喘大鼠氣道重塑不同階段及在不同階段給予活血化瘀單味藥丹參干預后的病理特征和肺組織中MMP-9的動態變化。為臨床治療和預防哮喘氣道重塑用藥最佳時機的選擇及使用規律提供實驗依據，并拓展中藥丹參調節和改善哮喘氣道重塑的新用途。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SPF級SD成年雄性大鼠70只，4～6周齡，平均體重（180±20）g，購自四川省醫學科學院實驗動物研究所，許可證號：SCXK（川）2013-24，合格證號：0018160，實驗動物隨機分成正常對照組、哮喘模型組（分為哮喘2周組、哮喘4周組、哮喘8周組）、丹參干預組（分為丹參2周組、丹參4周組、丹參8周組）共計3個大組，7個小組。依據分組不同分籠飼養，可以自由進食去卵清蛋白（包括雞蛋）的飼料和水，常規飼養于云南中醫學院實驗動物中心層流架。

1.2 藥物及制備

中藥丹參購自昆明福林堂藥業有限公司，使用前水煎3次后濃縮成含生藥1 g/mL的混懸液。

1.3 試劑及儀器設備

卵清蛋白（OVA）、氫氧化鋁凝膠（美國Sigma公司）；大鼠MMP-9 ELISA試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司）。

大鼠霧化箱（有機玻璃，自制，大?。?5 cm×35 cm× 20 cm）；壓縮霧化器（PARI BOYN08，德國百瑞有限公司）；電子天平（AR124CN型，美國奧豪斯）；離心機（德國Eppendorf公司）；輪轉式切片機、組織烘/攤片機（德國Leica）；顯微鏡（日本Olympus）；酶標儀（美國分子儀器公司）；超純水系統（美國Millipore公司）等。

1.4 氣道重塑模型的建立

哮喘大鼠氣道重塑模型是在哮喘大鼠模型的基礎上延長激發時間而建立的[6-7]。哮喘模型組、丹參干預組第1天和第14天腹腔注射OVA-氫氧化鋁混懸液2 mL致敏（OVA 1 mg，氫氧化鋁100 mg，加生理鹽水至2 mL），于實驗第21天起將大鼠置于密閉容器內，予2%OVA生理鹽水霧化激發，30 min/次，隔天1次，哮喘2周組及丹參2周組，哮喘4周組及丹參4周組，哮喘8周組及丹參8周組持續時間分別為2、4、8周，正常對照組用生理鹽水代替OVA致敏和激發。實驗中觀察大鼠反應，出現煩躁不安、呼吸急促深快、腹肌抽搐、煩躁嗆咳及點頭運動等癥狀表明建立哮喘模型成功[8-10]。

1.5 藥物干預試驗

每次用藥前丹參水煎冷卻備用。每次激發前30 min對實驗動物進行腹腔注射給藥：正常對照組和哮喘模型組注射無菌蒸餾水，丹參干預組注射丹參水煎劑。注射劑量根據成人（60 kg）臨床一日用藥量按動物體表面積等效劑量換算出大鼠（200 g）等效用藥量。

1.6 取材及檢測方法

1.6.1 大鼠肺組織病理檢測各組大鼠末次激發后24 h，打開胸腔取下左肺組織，中性甲醛固定，石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅（HE）染色光學顯微鏡下觀察細支氣管、血管及肺泡的病理改變。

1.6.2 大鼠肺組織MMP-9檢測取各組大鼠右肺組織500 mg，加入生理鹽水1 mL，組織勻漿器充分研磨，離心取上清0.1 mL，加生理鹽水至1 mL，充分混勻后，再次離心后取上清液備測。采用ELISA檢測試劑盒測定上清液MMP-9含量，操作步驟參照試劑盒說明書進行，通過標準品吸光度（A）值繪制標準曲線，然后計算各樣本MMP-9含量。

1.7 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠支氣管肺組織病理學改變

正常對照組：大鼠肺組織未見炎癥細胞浸潤，支氣管管腔規則，氣道黏膜上皮及肺泡結構完整，肺泡間隔窄，氣道平滑肌薄，肺泡腔透亮，無上皮脫落損傷，黏膜無水腫（圖1A）。哮喘模型組：2周組支氣管可見黏液栓，氣道有損傷，肺泡間隔不同程度增寬，部分斷裂，氣管與血管周圍有炎癥細胞浸潤（圖1B）；4周組可見杯狀細胞增生，基底膜增厚，肺泡間隔不同程度增寬，輕度充血水腫，氣管周圍炎癥細胞浸潤（圖1C）；8周組大量密集炎癥細胞浸潤，可見黏液栓，肺泡融合、不同程度斷裂，平滑肌增生（圖1D）。丹參干預組：2周組支氣管較規則，炎癥細胞浸潤減少（圖1E）；4周組增生細胞減少，肺泡大小相似，充血、水腫減輕，少量炎癥細胞浸潤（圖1F）；8周組支氣管管壁趨于正常，上皮結構較完整，管壁未見增厚，浸潤的炎癥細胞減少，無明顯炎性滲出（圖1G）。

2.2 各組大鼠肺組織中MMP-9含量比較

與正常對照組比較，哮喘2周組肺組織中MMP-9含量有所升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），而哮喘4、8周組肺組織中MMP-9含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05、P＜0.01）；與哮喘2周組比較，丹參2周組肺組織中MMP-9含量有所降低，但差異無統計學意義（P＞0.05），而哮喘8周組肺組織中MMP-9含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與哮喘4周組比較，丹參4周組肺組織中MMP-9含量有所降低，但差異無統計學意義（P＞0.05），而哮喘8周組肺組織中MMP-9含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與哮喘8周組比較，丹參8周組肺組織中MMP-9含量顯著降低，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠肺組織中MMP-9含量比較（ng/mL，)

表1 各組大鼠肺組織中MMP-9含量比較（ng/mL，)

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與哮喘2周組比較，△P＜0.05；與哮喘4周組比較，▲P＜0.05；與哮喘8周組比較，▽P＜0.01；MMP-9：基質金屬蛋白酶-9

組別只數MMP-9正常對照組哮喘2周組哮喘4周組哮喘8周組丹參2周組丹參4周組丹參8周組10 9 7 7 8 7 7 1.99±0.29 2.29±0.51 2.43±0.40*3.01±0.31**△▲1.93±0.30 2.06±0.49 2.10±0.20▽

3 討論

近年來有效改善氣道重塑成為哮喘防治的新方向，國內關于哮喘氣道重塑研究成為哮喘研究中的亮點。西藥以糖皮質激素的研究為主，但糖皮質激素能否抑制哮喘氣道重塑仍存在爭議[11-12]。此外，糖皮質激素的眾多副作用一直使其極富爭議性。

中醫藥注重“整體調節，扶正固本，平衡陰陽”的總原則，對哮喘氣道重塑有良好的治療效果[13]。大多數中醫醫家都認同，在不同證型的纖維化中，瘀血是重要病理產物。因此，活血化瘀是治療器官纖維化的大法[14]。王文建等[6]、張力江等[15]均證實川芎嗪、藍玉簪顆粒（主要成分為藏藥藍玉簪龍膽和三七總皂苷）等活血化瘀中藥可以有效減輕哮喘氣道重塑。丹參具有抗纖維化、抗菌、抗病毒、免疫調節等作用，可通過這些作用多靶點、多層次干預氣道重塑的形成，有效地改善或阻斷哮喘大鼠氣道重塑。其機制可能如下：①活血化瘀，對抗氧自由基，改善微循環，有利于及時清除氣道上的炎性因子及免疫復合物；②調節免疫功能，既可促進單核-巨噬細胞的吞噬作用，加快清除免疫復合物，又可通過抑制相應器官組織中炎性因子的含量抑制免疫反應對靶器官的損傷；③抑制成纖維細胞增殖或誘導成纖維細胞凋亡，減少膠原合成和分泌[16]；④抑制血小板聚集與活化[17]。本實驗證實丹參對抗哮喘氣道炎癥及氣道重塑均有一定作用，它能減輕哮喘氣道重塑已形成的各種結構改變，包括氣道壁上皮層增厚、上皮下膠原沉積及平滑肌層增厚及炎癥細胞浸潤。

MMP-9是特異性降解ECM的鋅依賴性蛋白酶家族，在氣道重塑中起重要作用。作為與哮喘氣道重塑關系最為密切的基質金屬蛋白酶，MMP-9主要負責降解ECM，在哮喘狀態下，MMP-9的過度表達不僅能導致ECM結構重塑，而且能誘導嗜酸粒細胞遷移并影響氣道平滑肌細胞增殖與遷移，進而誘發哮喘氣道重塑，因此抑制MMP-9表達已被認為是改善哮喘氣道重塑的重要機制之一[18]。本實驗提示，丹參可以降低哮喘氣道重塑大鼠肺組織中MMP-9的表達，起到改善哮喘氣道重塑的作用。從藥物作用時間來看，8周干預效果為佳。

同時，本實驗結果提示，在哮喘大鼠模型（以OVA-氫氧化鋁混懸液致敏激發大鼠）的基礎上延長激發時間可以建立哮喘氣道重塑模型，持續作用2周以上大鼠即可出現不同程度氣道重塑的表現，隨激發時間延長，氣道重塑越明顯，從效果來看，造模持續作用時間以8周為佳。

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Effects of Salvia Miltiorrhiza on airway remodeling and MMP-9 in rats with asthma

LI Yuqing ZHAO Wenjuan XIA Yonghui LI Yan CHEN Jing
Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Yunnan Province,Kunming 650500,China

ObjectiveTo study the effects of Salvia Miltiorrhiza on airway remodeling and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)in rats with asthma.MethodsSeventy SPF male adult SD rats were randomly divided into normal control group,asthma model group(asthmatic two-weeks group,asthmatic four-weeks group and asthmatic eight-weeks group), Salvia Miltiorrhiza intervention group(Salvia Miltiorrhiza two-weeks group,Salvia Miltiorrhiza four-weeks group and Salvia Miltiorrhiza eight-weeks group).Ovalbumin(OVA)-hydroxide suspension was applied to stimulate the remodeling of asthmatic airway in rats,for 2,4,8 weeks respectively.The pathological changes on the lung tissue of asthmatic rats were observed,ELISA was used to detect the level of MMP-9 in lung tissue of rats.ResultsThe results indicated that Salvia Miltiorrhiza improved infiltration of airways inflammatory cells and thickening of bronchial smooth muscle cells in asthmatic rats.Compared with normal control group[(1.99±0.29)ng/mL],the content of MMP-9 in lung tissue of asthmatic four weeks-group[(2.43±0.40)ng/mL]and asthmatic eight-weeks group[(3.01±0.31)ng/mL]increased(P＜0.05,P＜0.01);compared with asthmatic two-weeks group[(2.29±0.51)ng/mL],asthmatic four-weeks group[(2.43± 0.40)ng/mL],the content of MMP-9 in lung tissue of asthmatic eight-weeks group[(3.01±0.31)ng/mL]increased(P＜0.05);compared with asthmatic eight weeks-group[(3.01±0.31)ng/mL],the content of MMP-9 in lung tissue of Salvia Miltiorrhiza eight-weeks group[(2.10±0.20)ng/mL]decreased significantly(P＜0.01).ConclusionSalvia Miltiorrhiza can inhibit the secretion of MMP-9 in lung tissue of asthmatic rats,improve the state of airway remodeling in asthmatic rats.

Salvia Miltiorrhiza;Bronchial asthma;Airway remodeling;Matrix metalloproteinases-9

R965

A

1673-7210（2015）07（b）-0012-04

2015-04-15本文編輯：李亞聰）

云南省教育廳科學研究基金項目（2013Y241）；云南省應用基礎研究項目（2014FZ088）。

李玉卿（1979.4-），女，天津人，昆明醫科大學生物化學與分子生物學專業在讀碩士研究生；研究方向：中醫藥在生物學中的應用；專業擅長：基礎醫學實驗研究。

陳靜（1978.8-），女，上海人，碩士；研究方向：病原生物學與免疫學；專業擅長：病原生物學與免疫學科研及教學。