狗牙根黑粉菌冬孢子萌發影響因素及產孢培養基篩選

羅海瀾+王飛+馬旭園+張群之+羅海淑+劉少娟

摘要：研究不同溫度、水分含量、光照條件、pH值對狗牙根黑粉菌冬孢子萌發的影響，結果表明，溫度23～28℃、光照與黑暗間隔12h、pH值5～7的條件最適合冬孢子萌發；同時，還觀察和描述了狗牙根黑粉菌冬孢子的形態特征和萌發過程；此外，還研究了不同培養基對次生小孢子形態及產孢數量的影響，結果發現9種培養基均能產孢，在4%葡萄糖酵母膏液體培養基中產孢量最多，存在3種不同形態的次生孢子，帶莢膜的次生孢子無活性。

關鍵詞：狗牙根黑粉菌；冬孢子；萌發率；產孢培養基；次生孢子

中圖分類號：S432.4+4文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0166-03

狗牙根[Cynodondactylon（L.）Pers.]因其根莖繁殖能力強、生長快、耐踐踏、抗旱性強，成為鋪設運動場、停機坪、高爾夫果嶺、公園、庭院綠化的主要草坪草種[1-2]。但近年來，狗牙根黑穗病在我國發生普遍且態勢嚴重，嚴重影響我國草坪質量及其他場地綠化效果。狗牙根黑穗病是由擔子菌亞門黑粉菌目黑粉菌屬狗牙根黑粉菌引起的一種的真菌性病害。狗牙根黑穗病是系統侵染，引發全株性病害。最為直觀明顯的癥狀即開花期穗產生充滿孢子堆的病癭，表現為一種典型的苗期侵染、花期發病的癥狀。感病植物不能正常開花結子，導致植株不育，一般7—9月為黑穗病發病高峰期[3]。狗牙根黑粉菌主要靠冬孢子傳播，匍匐莖也能傳播。Garcia-Guzman等發現，黑粉菌通過來自種皮或土壤的越冬孢子菌絲侵染發芽種子的胚芽鞘，并擴散至整個植物組織，黑粉菌對狗牙根的種子萌發、出苗無影響，但被其侵染的狗芽根匍匐枝的生長、干物質總量、競爭力都明顯降低了[4]。目前，國內對狗牙根黑穗病的關注不多，狗牙根黑粉菌的致病機理尚不清楚。因此，本研究對狗牙根黑粉菌冬孢子的萌發條件、萌發過程及黑粉菌產次生孢子培養基進行探索，為進一步研究狗牙根黑粉菌的致病機制及該病原菌與狗牙根之間的互作提供參考。

1材料與方法

1.1材料

狗牙根黑穗病標樣采自漯河醫學高等?？茖W校的校園草坪，室內自然風干后于室內紙袋保存。試驗用冬孢子取自發病穗，黑粉菌菌株LHL1由筆者所在實驗室分離、鑒定，保存于中國武漢菌株保藏中心。

1.2冬孢子的分離

選取未抽穗的病穗，在超凈工作臺中用75%乙醇消毒5s，再用0.1%氯化汞消毒4min，然后用無菌水漂洗5次。用無菌鑷子將穗外膜撕開，再輕刮下病穗上的黑粉菌冬孢子于無菌水中制成冬孢子懸浮液備用，在顯微鏡下用血球計數板統計，冬孢子的濃度為10萬個/mL。

1.3不同因素對冬孢子萌發的影響

1.3.1光照對冬孢子萌發的影響

取100μL冬孢子懸浮液并用三角玻璃棒均勻涂布于PSA（馬鈴薯蔗糖固體培養）平板上，將PSA平板放在溫度為28℃的培養箱內，且分別置于連續光照（日光燈，光強1400lx）、12h/12h光暗交替、黑暗條件下培養，于16h后顯微鏡下觀察、統計并比較這3種條件下冬孢子的萌發率。

1.3.2水分對冬孢子萌發的影響

室溫下將冬孢子分別浸于無菌水中0、12、24、36、72h，吸取冬孢子懸浮液100μL均勻涂布于PSA平板上，該平板放在28℃、光照（日光燈，光強1400lx）條件下的培養箱內培養，分別于16h后顯微鏡下觀察并統計不同浸水時間下的冬孢子萌發率。

1.3.3溫度對冬孢子萌發的影響

取100μL冬孢子懸浮液并用三角玻璃棒均勻涂布于PSA平板上，將PSA平板放在光照（日光燈，光強1400lx）條件下的培養箱中，分別在15、18、23、28、33、38℃等6個溫度條件下培養，16h后顯微鏡下觀察并統計不同溫度下的冬孢子萌發率。

1.3.4pH值對冬孢子萌發的影響

用2mol/LHCl和2mol/LNaOH調節PSA培養基的初始pH值為4、5、6、7、8、9、10，取100μL冬孢子懸浮液均勻涂布于PSA平板上，將PSA平板放在28℃、光照（日光燈，光強1400lx）條件下的培養箱中培養，16h后顯微鏡下觀察并統計不同初始pH值的PSA培養基平板上冬孢子的萌發率。

1.4狗牙根黑粉菌冬孢子萌發及形態觀察

用改良玻片培養法觀察冬孢子的萌發情況，具體做法如下：先將制備好的無菌冬孢子懸浮液與融化的無菌低熔點瓊脂糖混合，用毛細滴管吸取孢子與瓊脂糖混合液滴在無菌載玻片上，迅速蓋上蓋玻片并輕壓使滴液分散成薄層，置于鋪有濾紙的無菌培養皿中；再滴加數滴無菌水，蓋上培養皿蓋，整個過程在無菌超凈臺上完成。培養皿放置于23℃光照培養箱中培養6、24h后取出，經苯胺藍染色20min，用脫色液脫色2h后于顯微鏡下觀察冬孢子的萌發形態。

1.5狗牙根黑粉菌產孢培養基的篩選試驗

利用馬鈴薯葡萄糖液體培養基、馬鈴薯蔗糖液體培養基、燕麥液體培養基、麩皮液體培養基、玉米粉液體培養基、完全液體培養基、4%葡萄糖酵母膏液體培養、2%甘油酵母膏液體培養基、狗牙根干草酵母膏液體培養基9種液體培養基分別對狗牙根黑粉菌產孢效果和孢子形態進行試驗。

馬鈴薯葡萄糖液體培養基、馬鈴薯蔗糖液體培養基配方參照文獻[5]；燕麥液體培養基、麩皮液體培養基、玉米粉液體培養基配方參照文獻[6]；完全液體培養基配方參照文獻[7]；4%葡萄糖酵母膏液體培養基、2%甘油酵母膏液體培養基配方參照文獻[8]；狗牙根干草酵母膏液體培養基配方：50g狗牙根干草在鍋里煮沸后繼續煮0.5h，然后用紗布過濾得液體，添加10g酵母膏，用自來水加到1000mL。

將保存于4℃營養瓊脂斜面培養基上的LHL1菌株接種于PSA固體培養基上，28℃培養進行活化。無菌條件下用接種針從培養好的平皿中挑取一單菌落接種于裝有100mLPS液體培養基的250mL三角瓶中，在恒溫28℃、轉速200r/min的搖床中培養3d，成為種子液培養。按0.6%接種量吸取種子液轉接于含50mL液體培養基的250mL搖瓶中，在轉速為200r/min的條件下搖床振蕩培養，搖菌4d后，用膠頭滴管吸1滴菌液于載破片上，苯胺藍染色后，顯微鏡下觀察次生孢子形態；菌液稀釋100倍用血球計數板統計次生孢子的數量。

2結果與分析

2.1不同因素對冬孢子萌發的影響

2.1.1光照條件對冬孢子萌發的影響

試驗結果表明，光照、黑暗條件下，狗牙根黑粉菌冬孢子都能萌發，且光照能促進冬孢子萌發。持續光照培養的冬孢子萌發率為31%，光照與黑暗間隔12h培養的萌發率為40%，持續黑暗培養萌發率為27%左右，說明在自然光周期條件下萌發較好，這與玉米瘤黑粉菌冬孢子萌發對光的需求[9]一致。

2.1.2水分條件對冬孢子萌發的影響

試驗結果表明，冬孢子浸泡0～72h都能萌發，且浸泡48h的孢子萌發率最高；在0～48h范圍內隨著浸水時間延長，冬孢子的萌發率有所提高。與水稻黑粉菌冬孢子要浸泡24h才能萌發相比，狗牙根黑粉菌冬孢子萌發對水分的需求更低，這可能與在干燥器內保存比在室內紙袋中保存冬孢子散失的水分更多有關[7]。然而，一直浸泡在無菌水中的冬孢子萌發率有所降低，這可能與水中氧氣含量低，不能滿足冬孢子萌發對氧氣的需求有關。這與玉米瘤黑粉菌及水稻黑粉菌冬孢子試驗的結果[7，9]相似。

2.1.3溫度對冬孢子萌發的影響

圖1顯示，在15～38℃范圍內，冬孢子都能萌發。在18～33℃下，冬孢子都能較好地萌發，其中23℃左右最適合冬孢子萌發，此時在PSA平板上培養16h的孢子萌發率高達53%，培養36h時萌發的孢子已長成大菌落，無法再統計萌發率，此時肉眼可見白色菌落，說明狗牙根冬孢子萌發非?？?。

2.1.4pH值對冬孢子萌發的影響圖2顯示，在pH值為4～10的范圍內，冬孢子均可以萌發；在pH值為5～7時，冬孢子萌發率較高?？梢娖珘A性環境不利于冬孢子萌發。

2.2狗牙根黑粉菌冬孢子形態及萌發過程

圖3顯示，狗牙根黑粉菌冬孢子淡褐色或棕色，近球形或卵形，直徑為7～9μm，膜面光滑而薄，這與程建斌的描述[3]相符。本試驗結果顯示，冬孢子培養6h后開始萌發，24h后呈樹枝狀；冬孢子萌發產生先菌絲，一端萌發或兩端同時萌發，先菌絲上側生擔孢子；先菌絲有隔，偶見長先菌絲，長先菌絲上不產生擔孢子，短先菌絲上擔孢子多形成樹枝狀。

2.3LHL1菌株的形態特征

冬孢子在PSA平板上萌發后形成雪花樣白色菌落，從菌落中挑取單菌落進行分離培養得到菌株LHL1。菌株LHL1在PSA平板上28℃光照培養2周后，菌落直徑達到1.4cm左右，近圓形，邊緣整齊，正面乳白色，質地近緊密為一薄層，背面黃褐色（圖4-A）。顯微鏡下LHL1菌為長條形，一端膨大，一端細長，分裂生長（圖4-B）。

2.4不同液體培養基對LHL1生物量及產孢的影響

如圖5所示，9種液體培養基以馬鈴薯蔗糖液體培養基生物量最大，其他從大到小依次為4%葡萄糖酵母膏培養基、2%甘油酵母膏液體培養基、完全液體培養基、馬鈴薯葡萄糖液體培養基、玉米粉液體培養基、燕麥液體培養基、狗牙根干草酵母膏液體培養、麩皮液體培養基。圖5還顯示，9種液體培養基均能夠產生次生孢子，但不同培養基的產孢量和孢子形態不同，其中馬鈴薯蔗糖液體培養基產孢量最大，玉米粉液體培養基產孢量最小。在燕麥、玉米粉、麩皮、完全及甘油酵母膏液體培養基中既有次生孢子產生又有菌絲存在，這也可能是在這5種培養基中產生次生孢子少的原因之一。

狗牙根黑粉菌的次生孢子形態有3種，第1種形態見圖6-A，這種次生孢子小而細，9種液體培養基除狗牙根干草酵母膏液體培養外都產生這種類型孢子；第2種形態見圖6-B，由狗牙根干草酵母膏液體培養產生，孢子個體大，中間間隔大，細胞質分布不均一；第3種形態見圖6-C，孢子有莢膜，此類孢子只在狗牙根干草馬鈴薯酵母膏液體中培養產生，在其他液體培養基和固體培養基中均無再生能力，其原因還有待進一步研究。

3結論與討論

綜合結果與分析得出以下結論：（1）溫度為23～28℃、光照與黑暗間隔12h、pH值為5～7的條件最適合狗牙根黑粉菌冬孢子萌發；（2）冬孢子萌發產生先菌絲，一端萌發或兩端同時萌發，先菌絲上側生擔孢子；（3）9種培養基均能產孢，以4%葡萄糖酵母膏、馬鈴薯葡萄糖、馬鈴薯蔗糖3種液體培養基產孢量最大，存在3種不同形態的次生孢子。

冬孢子從形成到萌發需要經歷后熟期、休眠期、復蘇期和萌發期4個時期，光照是打破冬孢子休眠的重要條件。本試驗結果顯示，光照對狗牙根黑粉菌冬孢子的萌發并不是必要條件，這與水稻黑粉菌冬孢子在黑暗條件下不能萌發不同[7]，說明可能不同黑粉菌冬孢子萌發對光的需求不同，但本研究中12h光暗交替培養能促進冬孢子萌發。水分是打破冬孢子休眠期進入復蘇期的必要條件，但本試驗中未浸水的冬孢子在PSA平板上也能萌發，這可能與筆者采用冬孢子的保存方式（紙包）有關。溫度是影響冬孢子萌發的重要因素之一，狗牙根黑粉菌冬孢子在15～38℃都能萌發，其中以溫度為23℃左右萌發率最高，這與水稻黑粉菌和玉米瘤黑粉菌冬孢子的萌發溫度[7，9]較一致，與玉米絲黑穗病原菌冬孢子的最佳萌發溫度為28℃[10]不同。pH值對冬孢子的萌發影響很大，弱酸性至中性環境有利于冬孢子萌發（pH值5～7），偏堿性環境不利于冬孢子萌發。這與酸性條件促進玉米瘤黑粉菌冬孢子、美味黑粉菌冬孢子萌發的結果[9，11]較為接近。本試驗中冬孢子萌發率偏低，可能與部分冬孢子因光照不足而沒有完成后熟作用以及試驗過程中使用了表面消毒劑等有關。

狗牙根黑穗病是一種苗期侵染、花期發病的病害，國內對該病病原菌的研究鮮有報道，國外的研究顯示狗牙根黑粉菌通過來自種皮或土壤越冬孢子的菌絲侵染發芽種子的胚芽鞘，并擴散至整個植物組織；但對狗牙根黑粉菌冬孢子的生物學特性及其具體的侵染過程、致病機理都未見報道。

通過9種液體培養基的產孢對比試驗發現，9種培養基均能產孢，以4%葡萄糖酵母膏、馬鈴薯葡萄糖、馬鈴薯蔗糖3種液體培養基產孢量較大，麩皮液體培養基產孢量最小。說明狗牙根黑粉菌產次生孢子對培養基要求不嚴，這與水稻黑粉菌[7]不同，也為進一步研究該病原菌致病機理以及與寄主的互作提供了有力保障。筆者還發現，狗牙根黑粉菌存在3種不同形態的次生孢子，其中帶莢膜的次生孢子無活性，其原因還有待于進一步研究。

參考文獻：[HJ1.3mm]

[1]孫吉雄.草坪學[M].蘭州：甘肅科學技術出版社，1989：98-99.

[2]唐欣，向佐湘，蘇鵬.狗牙根研究進展[J].作物研究，2009，23（增刊）：383-386.

[3]程建武.狗牙根黑穗病初報[J].中國草地，1992（1）：73.

[4]Garcia-GuzmanG，BurdonJ.ImpactoftheflowersmutUstilagocynodontis（Ustilaginaceae）ontheperformanceoftheclonalgrassCynodondactylon（Gramineae）[J].AmericanJournalofBotany，1997，84（11）：1565-1571.

[5]方中達.植病研究方法[M].北京：農業出版社，1979：83-87.

[6]邱海萍，柴榮耀，張震，等.馬唐致病菌株Mds0404的生物學特性[J].浙江農業學報，2008，20（3）：163-167.

[7]陳勝軍，王艷麗，張震，等.稻粒黑粉菌冬孢子萌發影響因素及其產孢培養基的篩選[J].浙江農業學報，2011，23（3）：572-576.

[8]Durieu-TrautmannO，TavlitzkiJ.ReversibleandpermanenteffectsofthecarbonsourcesandvariousantibioticsonthemorphologyandmetabolicpropertiesofUstilagocynodontiscells[J].TheJournalofCellBiology，1975，66（1）：102-113.

[9]劉正坪，趙占軍，張貴，等.玉米瘤黑粉病菌冬孢子生物學特性研究[J].現代化農業，1998，222（1）：12-13.

[10]劉洪亮，王險峰，劉輝，等.玉米絲黑穗病原菌冬孢子萌發條件研究[J].中國植保導刊，2007，27（12）：5-8.

[11]徐蟬，張敬澤，王曉清，等.美味黑粉菌冬孢子萌發條件的研究[J].長江蔬菜，2012（16）：104-107.

2結果與分析

2.1不同因素對冬孢子萌發的影響

2.1.1光照條件對冬孢子萌發的影響

試驗結果表明，光照、黑暗條件下，狗牙根黑粉菌冬孢子都能萌發，且光照能促進冬孢子萌發。持續光照培養的冬孢子萌發率為31%，光照與黑暗間隔12h培養的萌發率為40%，持續黑暗培養萌發率為27%左右，說明在自然光周期條件下萌發較好，這與玉米瘤黑粉菌冬孢子萌發對光的需求[9]一致。

2.1.2水分條件對冬孢子萌發的影響

試驗結果表明，冬孢子浸泡0～72h都能萌發，且浸泡48h的孢子萌發率最高；在0～48h范圍內隨著浸水時間延長，冬孢子的萌發率有所提高。與水稻黑粉菌冬孢子要浸泡24h才能萌發相比，狗牙根黑粉菌冬孢子萌發對水分的需求更低，這可能與在干燥器內保存比在室內紙袋中保存冬孢子散失的水分更多有關[7]。然而，一直浸泡在無菌水中的冬孢子萌發率有所降低，這可能與水中氧氣含量低，不能滿足冬孢子萌發對氧氣的需求有關。這與玉米瘤黑粉菌及水稻黑粉菌冬孢子試驗的結果[7，9]相似。

2.1.3溫度對冬孢子萌發的影響

圖1顯示，在15～38℃范圍內，冬孢子都能萌發。在18～33℃下，冬孢子都能較好地萌發，其中23℃左右最適合冬孢子萌發，此時在PSA平板上培養16h的孢子萌發率高達53%，培養36h時萌發的孢子已長成大菌落，無法再統計萌發率，此時肉眼可見白色菌落，說明狗牙根冬孢子萌發非?？?。

2.1.4pH值對冬孢子萌發的影響圖2顯示，在pH值為4～10的范圍內，冬孢子均可以萌發；在pH值為5～7時，冬孢子萌發率較高?？梢娖珘A性環境不利于冬孢子萌發。

2.2狗牙根黑粉菌冬孢子形態及萌發過程

圖3顯示，狗牙根黑粉菌冬孢子淡褐色或棕色，近球形或卵形，直徑為7～9μm，膜面光滑而薄，這與程建斌的描述[3]相符。本試驗結果顯示，冬孢子培養6h后開始萌發，24h后呈樹枝狀；冬孢子萌發產生先菌絲，一端萌發或兩端同時萌發，先菌絲上側生擔孢子；先菌絲有隔，偶見長先菌絲，長先菌絲上不產生擔孢子，短先菌絲上擔孢子多形成樹枝狀。

2.3LHL1菌株的形態特征

冬孢子在PSA平板上萌發后形成雪花樣白色菌落，從菌落中挑取單菌落進行分離培養得到菌株LHL1。菌株LHL1在PSA平板上28℃光照培養2周后，菌落直徑達到1.4cm左右，近圓形，邊緣整齊，正面乳白色，質地近緊密為一薄層，背面黃褐色（圖4-A）。顯微鏡下LHL1菌為長條形，一端膨大，一端細長，分裂生長（圖4-B）。

2.4不同液體培養基對LHL1生物量及產孢的影響

如圖5所示，9種液體培養基以馬鈴薯蔗糖液體培養基生物量最大，其他從大到小依次為4%葡萄糖酵母膏培養基、2%甘油酵母膏液體培養基、完全液體培養基、馬鈴薯葡萄糖液體培養基、玉米粉液體培養基、燕麥液體培養基、狗牙根干草酵母膏液體培養、麩皮液體培養基。圖5還顯示，9種液體培養基均能夠產生次生孢子，但不同培養基的產孢量和孢子形態不同，其中馬鈴薯蔗糖液體培養基產孢量最大，玉米粉液體培養基產孢量最小。在燕麥、玉米粉、麩皮、完全及甘油酵母膏液體培養基中既有次生孢子產生又有菌絲存在，這也可能是在這5種培養基中產生次生孢子少的原因之一。

狗牙根黑粉菌的次生孢子形態有3種，第1種形態見圖6-A，這種次生孢子小而細，9種液體培養基除狗牙根干草酵母膏液體培養外都產生這種類型孢子；第2種形態見圖6-B，由狗牙根干草酵母膏液體培養產生，孢子個體大，中間間隔大，細胞質分布不均一；第3種形態見圖6-C，孢子有莢膜，此類孢子只在狗牙根干草馬鈴薯酵母膏液體中培養產生，在其他液體培養基和固體培養基中均無再生能力，其原因還有待進一步研究。

3結論與討論

綜合結果與分析得出以下結論：（1）溫度為23～28℃、光照與黑暗間隔12h、pH值為5～7的條件最適合狗牙根黑粉菌冬孢子萌發；（2）冬孢子萌發產生先菌絲，一端萌發或兩端同時萌發，先菌絲上側生擔孢子；（3）9種培養基均能產孢，以4%葡萄糖酵母膏、馬鈴薯葡萄糖、馬鈴薯蔗糖3種液體培養基產孢量最大，存在3種不同形態的次生孢子。

冬孢子從形成到萌發需要經歷后熟期、休眠期、復蘇期和萌發期4個時期，光照是打破冬孢子休眠的重要條件。本試驗結果顯示，光照對狗牙根黑粉菌冬孢子的萌發并不是必要條件，這與水稻黑粉菌冬孢子在黑暗條件下不能萌發不同[7]，說明可能不同黑粉菌冬孢子萌發對光的需求不同，但本研究中12h光暗交替培養能促進冬孢子萌發。水分是打破冬孢子休眠期進入復蘇期的必要條件，但本試驗中未浸水的冬孢子在PSA平板上也能萌發，這可能與筆者采用冬孢子的保存方式（紙包）有關。溫度是影響冬孢子萌發的重要因素之一，狗牙根黑粉菌冬孢子在15～38℃都能萌發，其中以溫度為23℃左右萌發率最高，這與水稻黑粉菌和玉米瘤黑粉菌冬孢子的萌發溫度[7，9]較一致，與玉米絲黑穗病原菌冬孢子的最佳萌發溫度為28℃[10]不同。pH值對冬孢子的萌發影響很大，弱酸性至中性環境有利于冬孢子萌發（pH值5～7），偏堿性環境不利于冬孢子萌發。這與酸性條件促進玉米瘤黑粉菌冬孢子、美味黑粉菌冬孢子萌發的結果[9，11]較為接近。本試驗中冬孢子萌發率偏低，可能與部分冬孢子因光照不足而沒有完成后熟作用以及試驗過程中使用了表面消毒劑等有關。

狗牙根黑穗病是一種苗期侵染、花期發病的病害，國內對該病病原菌的研究鮮有報道，國外的研究顯示狗牙根黑粉菌通過來自種皮或土壤越冬孢子的菌絲侵染發芽種子的胚芽鞘，并擴散至整個植物組織；但對狗牙根黑粉菌冬孢子的生物學特性及其具體的侵染過程、致病機理都未見報道。

通過9種液體培養基的產孢對比試驗發現，9種培養基均能產孢，以4%葡萄糖酵母膏、馬鈴薯葡萄糖、馬鈴薯蔗糖3種液體培養基產孢量較大，麩皮液體培養基產孢量最小。說明狗牙根黑粉菌產次生孢子對培養基要求不嚴，這與水稻黑粉菌[7]不同，也為進一步研究該病原菌致病機理以及與寄主的互作提供了有力保障。筆者還發現，狗牙根黑粉菌存在3種不同形態的次生孢子，其中帶莢膜的次生孢子無活性，其原因還有待于進一步研究。

參考文獻：[HJ1.3mm]

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[7]陳勝軍，王艷麗，張震，等.稻粒黑粉菌冬孢子萌發影響因素及其產孢培養基的篩選[J].浙江農業學報，2011，23（3）：572-576.

[8]Durieu-TrautmannO，TavlitzkiJ.ReversibleandpermanenteffectsofthecarbonsourcesandvariousantibioticsonthemorphologyandmetabolicpropertiesofUstilagocynodontiscells[J].TheJournalofCellBiology，1975，66（1）：102-113.

[9]劉正坪，趙占軍，張貴，等.玉米瘤黑粉病菌冬孢子生物學特性研究[J].現代化農業，1998，222（1）：12-13.

[10]劉洪亮，王險峰，劉輝，等.玉米絲黑穗病原菌冬孢子萌發條件研究[J].中國植保導刊，2007，27（12）：5-8.

[11]徐蟬，張敬澤，王曉清，等.美味黑粉菌冬孢子萌發條件的研究[J].長江蔬菜，2012（16）：104-107.

2結果與分析

2.1不同因素對冬孢子萌發的影響

2.1.1光照條件對冬孢子萌發的影響

試驗結果表明，光照、黑暗條件下，狗牙根黑粉菌冬孢子都能萌發，且光照能促進冬孢子萌發。持續光照培養的冬孢子萌發率為31%，光照與黑暗間隔12h培養的萌發率為40%，持續黑暗培養萌發率為27%左右，說明在自然光周期條件下萌發較好，這與玉米瘤黑粉菌冬孢子萌發對光的需求[9]一致。

2.1.2水分條件對冬孢子萌發的影響

試驗結果表明，冬孢子浸泡0～72h都能萌發，且浸泡48h的孢子萌發率最高；在0～48h范圍內隨著浸水時間延長，冬孢子的萌發率有所提高。與水稻黑粉菌冬孢子要浸泡24h才能萌發相比，狗牙根黑粉菌冬孢子萌發對水分的需求更低，這可能與在干燥器內保存比在室內紙袋中保存冬孢子散失的水分更多有關[7]。然而，一直浸泡在無菌水中的冬孢子萌發率有所降低，這可能與水中氧氣含量低，不能滿足冬孢子萌發對氧氣的需求有關。這與玉米瘤黑粉菌及水稻黑粉菌冬孢子試驗的結果[7，9]相似。

2.1.3溫度對冬孢子萌發的影響

圖1顯示，在15～38℃范圍內，冬孢子都能萌發。在18～33℃下，冬孢子都能較好地萌發，其中23℃左右最適合冬孢子萌發，此時在PSA平板上培養16h的孢子萌發率高達53%，培養36h時萌發的孢子已長成大菌落，無法再統計萌發率，此時肉眼可見白色菌落，說明狗牙根冬孢子萌發非?？?。

2.1.4pH值對冬孢子萌發的影響圖2顯示，在pH值為4～10的范圍內，冬孢子均可以萌發；在pH值為5～7時，冬孢子萌發率較高?？梢娖珘A性環境不利于冬孢子萌發。

2.2狗牙根黑粉菌冬孢子形態及萌發過程

圖3顯示，狗牙根黑粉菌冬孢子淡褐色或棕色，近球形或卵形，直徑為7～9μm，膜面光滑而薄，這與程建斌的描述[3]相符。本試驗結果顯示，冬孢子培養6h后開始萌發，24h后呈樹枝狀；冬孢子萌發產生先菌絲，一端萌發或兩端同時萌發，先菌絲上側生擔孢子；先菌絲有隔，偶見長先菌絲，長先菌絲上不產生擔孢子，短先菌絲上擔孢子多形成樹枝狀。

2.3LHL1菌株的形態特征

冬孢子在PSA平板上萌發后形成雪花樣白色菌落，從菌落中挑取單菌落進行分離培養得到菌株LHL1。菌株LHL1在PSA平板上28℃光照培養2周后，菌落直徑達到1.4cm左右，近圓形，邊緣整齊，正面乳白色，質地近緊密為一薄層，背面黃褐色（圖4-A）。顯微鏡下LHL1菌為長條形，一端膨大，一端細長，分裂生長（圖4-B）。

2.4不同液體培養基對LHL1生物量及產孢的影響

如圖5所示，9種液體培養基以馬鈴薯蔗糖液體培養基生物量最大，其他從大到小依次為4%葡萄糖酵母膏培養基、2%甘油酵母膏液體培養基、完全液體培養基、馬鈴薯葡萄糖液體培養基、玉米粉液體培養基、燕麥液體培養基、狗牙根干草酵母膏液體培養、麩皮液體培養基。圖5還顯示，9種液體培養基均能夠產生次生孢子，但不同培養基的產孢量和孢子形態不同，其中馬鈴薯蔗糖液體培養基產孢量最大，玉米粉液體培養基產孢量最小。在燕麥、玉米粉、麩皮、完全及甘油酵母膏液體培養基中既有次生孢子產生又有菌絲存在，這也可能是在這5種培養基中產生次生孢子少的原因之一。

狗牙根黑粉菌的次生孢子形態有3種，第1種形態見圖6-A，這種次生孢子小而細，9種液體培養基除狗牙根干草酵母膏液體培養外都產生這種類型孢子；第2種形態見圖6-B，由狗牙根干草酵母膏液體培養產生，孢子個體大，中間間隔大，細胞質分布不均一；第3種形態見圖6-C，孢子有莢膜，此類孢子只在狗牙根干草馬鈴薯酵母膏液體中培養產生，在其他液體培養基和固體培養基中均無再生能力，其原因還有待進一步研究。

3結論與討論

綜合結果與分析得出以下結論：（1）溫度為23～28℃、光照與黑暗間隔12h、pH值為5～7的條件最適合狗牙根黑粉菌冬孢子萌發；（2）冬孢子萌發產生先菌絲，一端萌發或兩端同時萌發，先菌絲上側生擔孢子；（3）9種培養基均能產孢，以4%葡萄糖酵母膏、馬鈴薯葡萄糖、馬鈴薯蔗糖3種液體培養基產孢量最大，存在3種不同形態的次生孢子。

冬孢子從形成到萌發需要經歷后熟期、休眠期、復蘇期和萌發期4個時期，光照是打破冬孢子休眠的重要條件。本試驗結果顯示，光照對狗牙根黑粉菌冬孢子的萌發并不是必要條件，這與水稻黑粉菌冬孢子在黑暗條件下不能萌發不同[7]，說明可能不同黑粉菌冬孢子萌發對光的需求不同，但本研究中12h光暗交替培養能促進冬孢子萌發。水分是打破冬孢子休眠期進入復蘇期的必要條件，但本試驗中未浸水的冬孢子在PSA平板上也能萌發，這可能與筆者采用冬孢子的保存方式（紙包）有關。溫度是影響冬孢子萌發的重要因素之一，狗牙根黑粉菌冬孢子在15～38℃都能萌發，其中以溫度為23℃左右萌發率最高，這與水稻黑粉菌和玉米瘤黑粉菌冬孢子的萌發溫度[7，9]較一致，與玉米絲黑穗病原菌冬孢子的最佳萌發溫度為28℃[10]不同。pH值對冬孢子的萌發影響很大，弱酸性至中性環境有利于冬孢子萌發（pH值5～7），偏堿性環境不利于冬孢子萌發。這與酸性條件促進玉米瘤黑粉菌冬孢子、美味黑粉菌冬孢子萌發的結果[9，11]較為接近。本試驗中冬孢子萌發率偏低，可能與部分冬孢子因光照不足而沒有完成后熟作用以及試驗過程中使用了表面消毒劑等有關。

狗牙根黑穗病是一種苗期侵染、花期發病的病害，國內對該病病原菌的研究鮮有報道，國外的研究顯示狗牙根黑粉菌通過來自種皮或土壤越冬孢子的菌絲侵染發芽種子的胚芽鞘，并擴散至整個植物組織；但對狗牙根黑粉菌冬孢子的生物學特性及其具體的侵染過程、致病機理都未見報道。

通過9種液體培養基的產孢對比試驗發現，9種培養基均能產孢，以4%葡萄糖酵母膏、馬鈴薯葡萄糖、馬鈴薯蔗糖3種液體培養基產孢量較大，麩皮液體培養基產孢量最小。說明狗牙根黑粉菌產次生孢子對培養基要求不嚴，這與水稻黑粉菌[7]不同，也為進一步研究該病原菌致病機理以及與寄主的互作提供了有力保障。筆者還發現，狗牙根黑粉菌存在3種不同形態的次生孢子，其中帶莢膜的次生孢子無活性，其原因還有待于進一步研究。

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