楓香脂揮發油對大鼠離體胸主動脈的舒張作用

李建明， 王 政，陳 川*， 宋清宏

（1.上海市中醫老年醫學研究所，上海200031；2.上海中醫藥大學中藥學院，上海201203）

楓香脂揮發油對大鼠離體胸主動脈的舒張作用

李建明1， 王 政2，陳 川1*， 宋清宏1

（1.上海市中醫老年醫學研究所，上海200031；2.上海中醫藥大學中藥學院，上海201203）

目的研究水蒸汽蒸餾法提取楓香脂揮發油對大鼠離體胸主動脈的舒張作用，并探討其可能機制。方法楓香脂揮發油成分分析在氣相-質譜上進行，分離SD大鼠胸主動脈進行離體血管環實驗，觀察楓香脂揮發油對苯腎上腺素預收縮引起的舒縮功能的反應，并結合一氧化氮合酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯和環氧合酶抑制劑吲哚美辛，觀測楓香脂揮發油對血管環的作用。結果氣相-質譜結果顯示主要成分是三甲基肼、3-蒈烯、（1R）-2，6，6-三甲基二環［3.1.1］庚-2-烯、2-亞甲基-4，8，8-三甲基-4-乙烯基-二環 ［5.2.0］壬烷；累計體積分數的楓香脂揮發油對苯腎上腺素預收縮的血管環在內皮完整最大舒張率可達32.67%；結合左旋硝基精氨酸甲酯和吲哚美辛孵育0.5 h后，均顯示有明顯抑制血管舒張的作用。結論楓香脂揮發油對大鼠離體血管確實有舒張血管的作用，其機制可能跟一氧化氮合酶和環氧合酶的合成有關。

楓香脂；揮發油；氣相-質譜；血管環實驗；左旋硝基精氨酸甲酯；吲哚美辛

楓香脂為金縷梅科植物楓香［1-3］Liquidambar formosana Hance的干燥樹脂，楓香脂［4］性辛、微苦，平，歸肺、脾經，具有活血止痛、解毒、生肌的功效，用于跌撲損傷、癰疽腫痛、吐血、衄血等。關于楓香脂揮發性成分的研究已有一些報道，多用水蒸氣蒸餾法［5-6］提取其揮發性成分，對樣品的處理采取液-液萃取 （如用石油醚萃取蒸餾出的油等）。雖揮發油提取已有研究，但是其成分和藥理活性很少有報道。血管內皮功能［7］包括血管收縮舒張功能和內皮細胞分泌功能。血管的收縮舒張功能［8-10］是通過血管內皮細胞合成和分泌許多血管活性物質 （如內皮衍生舒張因子、內皮素等）實現的。針對此種情況，本研究主要結合舒張血管的不同抑制劑，研究楓香脂揮發油舒張血管的可能機制。

1 實驗方法

1.1 試劑與儀器 新鮮楓香脂購自云南省文山州。乙酰膽堿（ACh）（批號A2661-25G，Sigma）；苯腎上腺素（pheny1ephrine，PE）（批號P6126-5G）；五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）（批號H9523-25MG，Sigma）；左旋硝基精氨酸甲酯 （LNAME）（批號561334A；Sigma）；吲哚美辛（indomethacin）（批號51298-62-5，Adamas Reagent）。PawerLab血管功能測定系統（澳大利亞AD INSTRUMENTS）；4通道（6 m L水浴槽）多功能生理記錄儀（澳大利亞AD INSTRUMENTS）；氣相色譜儀（Agi1ent，GC6890N）；色譜柱（Agi1ent，HP-5）；二苯基聚硅氧烷共聚物色譜柱，頂空進樣皿（Agi1ent，7694E）；美國Agi1ent 7890A、5975C型氣相色譜-質譜聯用儀。

1.2 動物 SD大鼠，普通級，（200±20）g，雄性，合格證號SCXK 2012-0002，購買自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心。

1.3 楓香脂揮發油的提取 取一定量新鮮楓香脂，加5倍量水，水蒸汽提取8 h，將收集得到的楓香脂揮發油離心去水，量取體積，精確到0.1 mL，氣相-質譜測定成分。動物實驗時，揮發油使用二甲亞砜（DMSO）溶解。

1.4 血管環的制備 大鼠麻醉處死，迅速取出整體胸主動脈部位，置于4℃、含95%O2和5%CO2混合氣體預飽和的K-H液中，分離胸動脈剔除周圍脂肪組織制成3～5 mm血管環，將血管環固定于6 mL K-H液的浴槽內，37℃恒溫，并持續通入95%O2+5%CO2的混合氣體。每個血管環給予2.0 g拉力，每20 min更換K-H液1次，平衡80 min，以60 mmo1/L的KC1預收縮兩次，以誘發最大收縮度，用K-H液洗脫拉力穩定后，第一次加入五羥色胺20μmo1/L，待拉力達到坪值后加入10μmo1/L ACh，若血管舒張達80%以上，可認為內皮完整。內皮檢查完整度后，使用K-H液洗脫拉力穩定，第二次使用10μmo1/L苯腎上腺素PE，待拉力穩定后加入目標藥物，檢測藥物對血管環的作用（楓香脂揮發油體積分數均為0.75 mL/m L）。

1.5 觀察累計劑量的楓香脂揮發油對基礎狀態血管環的影響 將內皮完整的SD大鼠胸主動脈血管環隨機分為楓香脂揮發油組、對照組。以不同累計劑量作用于基礎狀態，實驗組 （n=6）與對照組（n=6）采用累計劑量使其終體積分數達到2.5× 10-7、5×10-7、1.0×10-6、2.0×10-6mL/mL，每一分鐘加一次，對照組以相應的DMSO溶解的K-H液代替揮發油加入量。

1.6 累計劑量楓香脂揮發油對PE預收縮內皮完整的影響 分組及加藥方法同 “1.5”項，實驗組（n=6）以不同累計劑量楓香脂揮發油作用于10 μmo1/L苯腎上腺素PE預收縮的血管環，觀察楓香脂揮發油對血管環的影響；對照組加入DMSO溶解的K-H液代替揮發油。

1.7 楓香脂揮發油對無鈣液預處理的的去內皮血管環的作用 實驗組 （n=6）將血管使用機械力取出血管內皮細胞，然后在無鈣液中穩定40 min，加入楓香脂揮發油終體積分數為 2.0×10-6m L/mL，共孵育30 min，加入10μmo1/L苯腎上腺素PE預收縮的血管環，觀察楓香脂揮發油的作用；對照組加入含有DMSO溶解的K-H液代替揮發油。

1.8 觀察楓香脂揮發油對一氧化氮合酶抑制劑LNAME預處理的PE預收縮的影響 實驗組（n= 6）用L-ANME（濃度為0.1 mmo1/L）孵育內皮完整的血管環20 min，以PE預收縮，觀察楓香脂揮發油的作用；對照組加入含有DMSO溶解的K-H液代替揮發油。

1.9 觀察楓香脂揮發油對環氧合酶抑制劑吲哚美辛預處理的PE預收縮的影響 實驗組 （n=6）用吲哚美辛（濃度為0.1 mmo1/L）孵育內皮完整的血管環20 min，以PE預收縮，觀察楓香脂揮發油的作用；對照組加入含有DMSO溶解的K-H液代替揮發油。

2 結果

2.1 楓香脂揮發油氣相-質譜（GC-MS）分析 根據前期實驗研究和文獻［2-3］調查確定，氣相色譜條件為HP-5MS毛細管柱（30 m×250μm×0.25 μm）；柱溫，起始柱溫100℃，然后以6℃/min升溫，至160℃時保留2 min，以2℃/min升溫，至190℃時保留3 min，以8℃/min升溫至240℃；進樣器溫度，310℃；載氣，He；分流比，2∶1；進樣量，1μL。質譜條件EI離子源；溫度280℃；電離電壓70 eV；掃描質量范圍，50.0～500 amu（m/z）；NIST05a譜庫，如圖1和表1。

圖1 楓香脂揮發油氣相-質譜離子峰Fig.1 GC-M S of volatile oil from Liquidambaris Resina

表1 楓香脂揮發油主要成分Tab.1 M ain components of volatile oil from Liquidambaris Resina

2.2 累計劑量的楓香脂揮發油對基礎狀態血管環的影響 以不同累計劑量作用于基礎狀態，實驗組（n=6）與對照組 （n=6）采用累計劑量使其終體積分數達到 2.5×10-7、5×10-7、1.0×10-6、2.0×10-6mL/mL。最終結果顯示，累計劑量的楓香脂對基礎狀態的血管環無影響。

2.3 累計劑量楓香脂揮發油對PE預收縮內皮完整的影響 實驗組 （n=6）以不同累計劑量楓香脂揮發油作用于10μmo1/L苯腎上腺素PE預收縮的血管環，以PE最大收縮度作為100%對照參考。結果顯示，不同累計體積分數的楓香脂揮發油對血管環有舒張作用，并且有體積分數依耐性舒張，在終劑量達到2.0×10-6m L/mL時，舒張最大，達到32.67%，如圖2。

圖2 累計劑量楓香脂揮發油對PE預收縮內皮完整的影響Fig.2 Effect of cumulative dose of Liquidambaris Resina volatile oil on PE pre-contracted artery rings

2.4 楓香脂揮發油對無鈣液預處理的的去內皮血管環的作用 無鈣液中穩定40min，加入楓香脂揮發油終體積分數為2.0×10-6m L/mL，共孵育30 min，孵育前用PE預收縮一次，孵育后PE預收縮一次，比較前后兩次收縮程度，以第二次收縮占第一次收縮程度百分率判斷。與空白組比較發現，無統計學意義，證明楓香脂揮發油舒張血管與血管內皮細胞釋放鈣離子無關，如圖3。

2.5 楓香脂揮發油對一氧化氮合酶抑制劑LNAME預處理的PE預收縮的影響 實驗組（n= 6）用L-ANME（濃度為0.1 mmo1/L）孵育內皮完整的血管環20 min，PE預收縮，以PE最大收縮度作為100%對照參考。觀察發現楓香脂揮發油相比于不加一氧化氮合酶抑制劑L-NAME，有明顯的抑制舒張的作用，如圖4。

2.6 楓香脂揮發油對環氧合酶抑制劑吲哚美辛預處理的PE預收縮的影響 實驗組（n=6）用環氧合酶抑制劑吲哚美辛（濃度為0.1 mmo1/L）孵育內皮完整的血管環20 min，PE預收縮，以PE最大收縮度作為100%對照參考。觀察發現楓香脂揮發油相比于不加環氧合酶抑制劑吲哚美辛，有明顯的抑制舒張的作用，如圖5。

3 結論

圖3 楓香脂揮發油對無鈣液預處理的的去內皮血管環的作用Fig.3 Effect of Liquidambaris Resina volatile oil on vascular ringsw ithout endothelium pretreated by calcium-free solution.

圖4 楓香脂揮發油對一氧化氮合酶抑制劑L-NAME預處理的PE預收縮的影響Fig.4 E ffect of Liquidambaris Resina volatile oil on PE p re-contraction pretreated by L-NAM E

經前期實驗工藝［3］，本課題組得到楓香脂揮發油得油率超過20%，楓香脂現在研究比較少，可以獲得的數據有限。楓香脂GC-MS結果顯示楓香脂揮發油主要成分是由 三甲基肼，3-蒈烯，（1R）-2，6，6-三甲基二環 ［3.1.1］庚-2-烯，2-亞甲基-4，8，8-三甲基-4-乙烯基-二環 ［5.2.0］壬烷組成，含有量超過80%，其各自藥理學研究還有待于進一步詳細研究。

圖5 楓香脂揮發油對環氧合酶抑制劑吲哚美辛預處理的PE預收縮的影響Fig.5 L.Resina volatile oil on PE pre-con traction pretreated by indomethacin

舒張血管作用途徑總的來說［11-13］，主要通過內皮依耐性增加舒血管活性物質NO及前列腺素的釋放，抑制縮血管物質如內皮素等的產生，非內皮途徑阻滯鈣離子通道、開放鉀離子通道等途徑發揮舒張血管的作用。楓香脂揮發油與水不溶，在實驗過程中我們使用DMSO與揮發油溶解，快速加入血管水浴槽，只有極少部分揮發油接觸到血管環產生作用，大部分與水分層，所以進一步與水充分接觸是我們進一步研究的保證。文章研究表明楓香脂揮發油具有明顯的舒張血管的作用，在其加入終體積分數達到2.0×10-6mL/mL，最大舒張率可達32.67%。經過無鈣液培育，發現其血管舒張基本是由于血管內皮細胞引起的，結合一氧化氮合酶抑制劑L-NAME研究我們發現，楓香脂揮發油舒張血管跟一氧化氮合酶合成有關，其有抑制合酶合成作用，結合環氧合酶抑制劑吲哚美辛我們也發現其舒張血管跟環氧合酶也有關。楓香脂揮發油舒張血管詳細機制還在進一步研究中。

［1］E1-ReadiM Z，Eid H H，Ashour M L，et al.Variations of the chemica1composition and bioactivity of essentia1oi1s from 1eaves and stems of Liquidambar styraciflua（A1tingiaceae）［J］.J Pharm Pharmacol，2013；65（11）：1653-1663.

［2］蔡愛華，趙志國，陳海珊，等.楓香與缺萼楓香果實揮發性成分的GC—MS分析［J］.桂林理工大學學報，2012，32（2）：245-249.

［3］李建明，宋清宏，耿洪亞，等.陰干對楓香脂中揮發油成分的影響［J］.中成藥，2014，36（4）：813-818.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：192.

［5］劉繼鑫，王克霞，李朝品，等.水蒸氣蒸餾法提取中藥揮發油存在的問題及解決方法［J］.時珍國醫國藥，2008，19（1）：97-98.

［6］張韻慧，馮 靖，晉興華，等.楓香葉揮發油化學成分的GC-MS分析［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（22）：81-83.

［7］李 夢，瑪依努爾·賽買提，李 昭，等.A型行為與高血壓患者心理社會事件及血管內皮功能的相關性［J］.中國心理衛生雜志，2008，22（10）：724-728.

［8］劉江華，宓寶斌，廖二元，等.波動性高糖對內皮細胞血管舒張因子合成的影響［J］.中國動脈硬化雜志，2006，14（1）：55-56.

［9］Itoh T，Kajiwara M，Kitamura K，et al.Effects of vasodi1ator agents on smooth musc1e ce11s of the coronary artery of the pig［J］.Br JPharmacol，1981，74（2）：455-468.

［10］Qui11ey C P，Lin Y S，McGiff JC.Ch1oride anion concentration as a determinant of rena1 vascu1ar responsiveness to vasoconstrictor agents［J］.Br J Pharmacol，1993，108（1）：106-110.

［11］王 政，蔣嘉燁，可 燕，等.三七花總皂苷對大鼠離體胸主動脈的舒張作用及其機制［J］.中國藥理學通報，2014，30（7）：956-960.

［12］Hedegaard E R，Stankevicius E，Simonsen U，et al.Nonendothe1ia1 endothe1in counteracts hypoxic vasodi1ation in porcine 1arge coronary arteries［J］.BMC Physiol，2011，11（1）：8.

［13］Durand M J，Gutterman DD.Diversity inmechanisms ofendothe1ium-dependent vasodi1ation in hea1th and disease［J］.Microcirculation，2013，20（3）：239-247.

Vasodilatory effect of Liquidambaris Resina volatile oil on rats aorta in vitro

LIJian-ming1， WANG Zheng2， CHEN Chuan1*， SONG Qing-hong1
（1.ShanghaiGeriatric Institute of ChineseMedicine，Shanghai200031，China；2.College of Pharmacy，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

AIMTo investigate the vasodi1atory effect of Liquidambaris Resina steam-vo1ati1e oi1on the iso1ated thoracica aorta and exp1ore its possib1emechanism.METHODSThe ana1ysis of Liquidambaris Resina vo1ati1e oi1was performed on gas chromatography-mass spectrometry.Iso1ated SD rataortic vascu1ar was used in vitro to the vascu1ar ring experiment，observing the pre-contraction effect caused by pheny1ephrine，aswe11as by nitric oxide synthase inhibitor L-NAME and cyc1ooxygenase inhibitor indomethacin on vascu1ar ring.RESULTSGC-MS data showed that themain constituents of vo1ati1e oi1were trimethy1-hydrazine，3-carene，（1R）-2，6，6-trimethy1bi-cyc1o［3.1.1］hept-2-ene，2-methy1ene-4，8，8-trimethy1-4-viny1-bicyc1o-［5.2.0］nonane.Vo1ati1e oi1 had a significant pre-contracted effect caused by PE，and the va1ue ofmaximum re1axation was32.67%.After L-NAME and indomethacin incubating with vascu1ar ring for 0.5 h，they cou1d marked1y inhibit vasodi1ation.CONCLUSIONLiquidambaris Resina vo1ati1e oi1has significant vasodi1ation for SD rats，and ismain1y re1ated to the activation of nitric oxide synthase and cyc1ooxygenase pathway.

Liquidambaris Resina；vo1ati1e oi1；GC-MS；vascu1ar ring experiment；L-NAME；indomethacin

R285.5

A

1001-1528（2015）08-1659-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.006

2014-08-19

李建明 （1967—），男，博士，研究員，研究方向為中醫老年醫學理論與技術、中醫藥防治老年病新技術和新產品研發。Te1：（021）6470010，18817395027，E-mai1：1ijianmingg@vip.sina.com

*通信作者：陳 川 （1963—），男，碩士生導師，主任醫師，研究方向為中醫藥防治老年性癡呆、動脈粥樣硬化及延緩衰老。Te1：（021）64720010，E-mai1：shagetcm@126.com