氧化損傷與遺傳毒性的檢測研究概況

呂惠萍，朱 琪 (菏澤學院化學化工系，山東菏澤 274000)

氧化損傷與遺傳毒性的檢測研究概況

呂惠萍，朱 琪 (菏澤學院化學化工系，山東菏澤 274000)

概述了氧化損傷與遺傳毒性的分子毒理學評價手段。簡單介紹和討論了活性氧自由基(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽解毒酶(GST)、丙二醛含量(MDA)、DNA損傷等生物學指標在毒理學領域的研究現狀，重點探討了彗星實驗技術(SCGE)在檢測遺傳毒性方面的應用情況。

活性氧化基；抗氧化酶系；解毒酶；丙二醛；SCGE

在毒理學領域，傳統的毒性測定方法對于判定污染物對生物的毒性效應必不可少，但已不能滿足評價和預測外來污染物對環境生物的早期毒害情況的需求。已有的數據大多集中在污染物對指示生物的急性毒性、慢性毒性以及對生物的繁殖行為、生長情況的影響。但是，由于環境中污染物的濃度增加而引起的生物死亡、生長受阻，繁殖能力下降導致的生態系統破壞，已屬于污染的晚期影響。并且，在污染早期，許多污染物含量都較低，達不到致死或影響生物生長的水平。因此，采用更加敏感的研究手段有利于預防早期污染。

在污染物進入環境后，對生物的作用開始在個體的分子水平上，然后在細胞、器官、個體、種群、群落、生態系統等各個水平上顯現出來[1]。所以，要分析污染物在各個水平和預測少量污染物對個體的潛在影響，盡早避免或減輕環境污染具有重要意義[2]。一些污染物在生物體內的代謝反應中會導致體內活性氧自由基增多，產生氧化應激。生物體自身的生化反應如酶類參加的反應會降低污染物的產生，反之，過量的自由基會對生物大分子如酶類、脂質、蛋白質、DNA造成損傷。污染物對生物體的氧化損傷和遺傳毒性已成為毒理學領域中的一個研究熱點，也是能夠早期預測污染物的生態毒性效應的一個重要方面。該研究簡要論述了氧化損傷與遺傳毒性的分子毒理學評價手段的最新進展、發展趨勢、研究熱點以及應用情況。

1 活性氧自由基(ROS)概述

1.1 ROS的產生ROS是生物體內生理性氧的代謝產物，在線粒體呼吸鏈部位由單電子傳遞給氧而產生，是引起蛋白質氧化損傷的重要因素。ROS具有很強的化學活性，主要包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)和脂質過氧化物的中間產物——烷氧自由基、烷過氧自由基等[3]。許多疾病、生命的衰老(特別是衰老性疾病)都涉及活性氧自由基反應。近年來，活性氧的檢測及抗氧化藥物的篩選在多個領域受到高度的重視。

ROS在生物體內的產生過程主要有酶反應和非酶反應，其中ROS產生的主要途徑是與線粒體呼吸鏈有關的酶的反應，而且這些ROS可以被機體所利用，顯示出十分重要的生理功能。Chance等[4]證明，產生ROS的重要場所是線粒體。在正常的生理情況下，線粒體需要消耗約2%的氧產生的ROS，由呼吸鏈底物端釋放出電子還原氧分子單電子，產生ROS的前體——超氧陰離子和過氧化氫。另外，一些外源性污染和刺激也能夠導致機體內ROS的增加。有研究表明，溫度、含氧量、鹽度、過渡金屬離子、農藥等因素都能夠誘導水生生物體內的ROS[5]。朱茂祥等[6]用一系列劑量的γ射線照射細胞，細胞內ROS顯著的增加。Song等[7]發現，六氯苯或過氯苯可以引起鯉魚肝臟和大腦的氧化應激狀態。雖然六氯苯作為一種持久性有機污染物已被斯德哥爾摩公約在全球范圍內禁止使用，但由于很多是工業過程的副產品，仍然持續地向環境中釋放。六氯苯引起機體ROS的增加，有兩個原因：一是作為脂溶性化合物，它可以與細胞色素結合而不易代謝，如此便拆開單加氧酶反應的電子轉移鏈，結果有利于活性氧自由基的產生；二是六氯苯的主要代謝物五氯苯酚是潛在的ROS產生源。

1.2 ROS的清除在正常的生理條件下，機體產生和清除ROS處于一個相對平衡的狀態。但是，在特殊生理條件或在外界的刺激下，體內ROS會不同程度地增加。生物體自身的代謝過程可以清除ROS，維持平衡狀態。

生物體內ROS清除劑包括以下兩類物質：一類是在抗氧化條件下，機體本身具有的酶系統和抗氧化劑；另一類是在病理條件下，加入外源抗氧化酶和抗氧化劑?？寡趸赣谐趸锲缁?SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSP-Px)、谷胱甘肽硫轉移酶(GST)等?？寡趸瘎┲饕幸韵?種：一類是水溶性抗氧化劑，包括N-乙酰半胱氨酸、白蛋白、VC等；另一類是脂溶性抗氧化劑，包括金屬絡合物、VA、VE、激素類、膽紅素等；另外，硒、銅、鋅等微量元素也可以間接地清除ROS。研究表明，ROS最強清除劑是番茄紅素[8]。VE作為天然的脂溶性抗氧化劑，對保護生物膜、脂溶性蛋白免受氧化損傷也有重要的作用[9]。

1.3 ROS的生物學意義生物體產生的ROS可以被機體所利用，并發揮十分重要的生理作用。首先，ROS可以參與核苷酸的還原、膠原蛋白合成、凝血酶原的合成等。而且，ROS可以參與殺菌和體內解毒。其次，ROS是機體細胞、組織、器官的產生和生長的重要信號分子。Sauer等[10]研究表明，ROS能促進胚胎心臟的生長和分化，同時ROS清除劑可抑制心肌的正常生長發育。Huang等[11]研究發現，如果將ROS的清除劑如乙酞水楊酸、N-乙酞半膚氨酸等用在鉻(VI)誘導的細胞凋亡中，那么會使凋亡的細胞減少。

過量的ROS會導致細胞損傷或細胞凋亡。ROS的活潑性和氧化反應能力都很強，能通過氧化作用攻擊細胞的生物大分子物質(核酸、蛋白質、糖類、脂質)。過量的ROS可與脂質分子發生過氧化反應，使得破壞細胞膜的通透性遭到破壞，而且可以使蛋白和蛋白酶變性或失活；或者通過堿基修飾損傷DNA，進而影響基因的表達。有研究表明，ROS與脂質分子的過氧化作用形成大量的脂氫過氧化物，對人體正常肺細胞中的蛋白質和DNA等生物大分子造成損傷。

1.4 ROS的檢測自由基具有性質活潑和反應性強的特點，既易還原又易氧化，其本身并不穩定。其檢測手段有以下幾種：電子自旋共振法(ESR)、高效液相色譜法、氣相色譜法、化學發光法、熒光分析法、分光光度法以及電化學方法。但是，這些檢測手段能夠直接測定的方法相當有限，所以在環境、醫學等領域迫切需要開發直接測定活性氧或其他自由基的檢測方法。

2 氧化損傷的生物學指標概述

由于污染物會引起生物體內活性氧自由基的大量產生，直接或間接地導致酶變性失活或誘導其活性增強。過量的ROS也能與脂質發生過氧化反應產生MDA，進一步損傷生物大分子，破壞遺傳物質。已有的研究常用抗氧化酶活性、解毒酶活性、脂質過氧化產物——丙二醛(MDA)、ROS、DNA損傷等指標評價污染物引起的氧化損傷程度[12-13]。

2.1 抗氧化酶系需氧生物為了阻止氧化損傷，機體形成有效的保護機制，做出相應的改變來適應外界環境?？寡趸改軌驕p緩氧化的速度，使生物體內活細胞產生催化劑，其中抗氧化酶系統在這種保護機制中起重要作用?？寡趸赶到y主要包括超SOD、CAT、過氧化物酶(POD)。

POD也被認為是生物保護酶之一，在許多植物和動物中普遍存在。POD通過一個二質子、二電子還原過程催化過氧化氫對底物AH的氧化：H2O2+ 2AH → 2H2O+ A2。其作用是催化過氧化氫與對各種有機物和無機物氫供體之間的氧化反應，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用[17]。SOD的存在可以保護CAT、POD酶免受超氧陰離子的損害，同時CAT和POD可以清除SOD催化生成的過氧化氫。三者互相保護，并且共同抵御外界引起的氧化脅迫壓力，組成了一個完整的防氧化鏈條。

2.2 解毒酶——谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)GST是廣泛存在于生物體內的一類多功能同工酶，是谷胱甘肽結合反應的關鍵酶，催化谷胱甘肽結合反應的起始步驟，主要存在于胞液中。它能夠起到解毒和消除自由基的雙重功能，避免生物大分子受到損傷。GST的功能之一是催化親電子類物質與GSH的巰基的結合，包括過氧化物、A，B-不飽和醛酮、烷基或芳香基化合物等物質。GST的普遍底物是2，4-二硝基氯苯(CDNB)，CDNB與GSH結合生成S-2，4-二硝基苯谷胱甘肽。GST作為Ⅱ相解毒酶，在機體處于氧化脅迫條件下參與清除過量的ROS。這是抵御氧化損傷的一種機制[18]。另外，GST也可以與一些疏水性強的物質結合如血紅素、膽酸、染料、激素等，使之親水性增強，通過代謝排出體外[19]。在GST發揮其解毒作用的同時，自身的活性會受到外源物質的影響。有研究表明，微粒體GST第49位半胱氨酸的巰基可以與過氧化氫、烷化劑等特異性結合，使得GST的活性增強[20]。

2.3 丙二醛(MDA)MDA分子式為OHC-CH2-CHO，分子量為72.06，是脂質過氧化反應的終產物。自由基和脂質物質發生過氧化反應，其產物為具有細胞毒性的MDA。它可引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合反應。發生脂質過氧化反應多是由于機體產生的ROS與生物膜中的多不飽和脂肪酸發生作用。這可以降低膜脂的流動性，減少膜的不飽和脂肪酸，并且生成過氧化產物。脂質過氧化作用具有極大的危害性。它可通過鏈式反應放大ROS的作用，把活性氧轉變為非自由基的質類分解產物。這些分解產物有的無害，有的則能導致功能及細胞代謝障礙，甚至細胞死亡。

因此，ROS引起的生物膜的脂質過氧化作用的危害表現在兩個方面。一是生物膜的流動性降低，正常的運輸吸收功能受阻；二是脂質過氧化產物(如丙二醛)可與蛋白質、核酸等生命大分子發生多肽鏈的鏈內交聯和鏈間交聯，改變其正常的結構和功能導致代謝異常，具有細胞毒性。測定機體組織中MDA含量，可以從側面反映出脂質過氧化程度，也是作為探索細胞損傷原因的一個重要方面[21]。

3 單細胞凝膠電泳(SCGE)概述

單細胞凝膠電泳具有周期短、敏感度高等優點，被廣泛應用于腫瘤發病機理、環境檢測、輻射生物學、遺傳毒理、診療、衰老和細胞凋亡機理的研究等方面。

3.1 DNA損傷及其檢測方法DNA 是由反向平行的兩條多聚核苷酸鏈構成的穩定的雙螺旋結構，其內部的堿基序列按堿基配對原則相互結合。堿基的種類、數量以及排列次序決定DNA分子所攜帶的遺傳信息。DNA穩定的雙螺旋結構可維系細胞和生物體的生命，保障生物體的生命特征得以傳承。但是，生物體內部及外部的很多因素均可能造成DNA分子結構的異常即DNA損傷[22]。通常所說的DNA損傷是指一級結構發生變化，其中包括堿基烷基化、堿基異構化、堿基丟失、堿基脫氮、鏈的斷裂、DNA交聯等。DNA損傷可以被生物體自身的一套完善的修復系統極大限度地修復，而未被修復的極少量DNA損傷是導致機體產生疾病、衰老及物種變異的原因[23]。

引發DNA損傷的因素分為物理因素和化學因素。物理因素包括高溫、紫外線和電離輻射等，如紫外線可能會導致RNA的轉錄停止和DNA復制停止等。電離輻射可直接導致成DNA鏈的斷裂損傷，也可以間接損傷DNA。在引起DNA損傷的因素中，化學因素占很大一部分，其中包括農藥、重金屬離子、堿基分子結構的改變產生的各種自由基都可以直接導致DNA損傷。

用于檢測DNA斷鏈和交聯的技術有堿洗脫技術和單細胞凝膠電泳技術。用于檢測DNA加和物的技術有吸收光譜移動法和色譜、質譜聯用法、熒光光譜測定法、32P后標記法、免疫法等。其他綜合性檢測方法有變性高效液相色譜分析、變性梯度凝膠電泳、姐妹染色單體交換分析、切割酶片段長度多態性分析、DNA芯片技術等。

單細胞凝膠電泳技術(SCGE)，也稱彗星實驗(Comet assay)，指單細胞水平上檢測真核細胞DNA的損傷與修復的熒光檢測方法，具有原位、快速、簡單、靈敏度等特征，被廣泛應用于環境生物監測、生物學、毒理學、醫學等領域，也常作為生物標志物分析環境污染的生物學效應。其原理是先在強堿溶液的作用下將瓊脂中的細胞裂解。裂解作用主要是使膜結構的穩定力遭到破壞，膜內的RNA、蛋白質和其他成分溶解，從而進入電解液中，但是DNA分子不能進入溶液中，仍在原位。高pH的解旋液促進DNA的變性和解旋，使得雙鏈容易變成單鏈、RNA全部水解。目前，常用的裂解液pH在13以上[24]，在此條件下DNA單鏈斷裂、堿性不穩定點、DNA交聯、DNA與蛋白質交聯以及不完全切除修復位點等損傷均能被檢測到。解旋后斷裂DNA片段的缺口部分陰電荷暴露了出來，受到外界電場力的作用，迫使從細胞核中遷移，并且向陽極移動，從而形成彗星圖像尾部；完好的DNA則仍在細胞核中，形成彗星圖像中心。所以，含DNA鏈的缺口越多，彗星圖像尾部的DNA越多，實驗圖像中彗星尾部的熒光強度越高，尾長越長。彗尾的長度和DNA含量可以反映DNA損傷的大小。目前，主要用彗星尾長、尾部DNA含量、Olive尾距3個參數來評價損傷程度。

3.2 SCGE及其在檢測遺傳毒性方面的應用研究表明，在遺傳毒性產生前可能有DNA 損傷域值。彗星實驗有助于探索毒物對DNA的直接損傷、DNA或染色體突變的可能性[25]。1999年3月25～26日國際遺傳毒性檢測程序工作會議(IWGTP)上堿性彗星實驗被認為最適合用來檢測各種物質的遺傳毒性。研究證實，SCGE 是研究低劑量遺傳毒理效應的有效工具，相比于其他DNA損傷檢測技術(如姐妹染色單體實驗)，在相對較低的毒物濃度下就可能發生顯著的DNA的斷鏈[26]。彗星實驗證明，草甘磷和阿特拉津等除草劑可使牛蛙的紅血球細胞產生DNA損傷[27]。Mitchelmore等[28]發現，硝基芘和苯并[a]芘在虹鱒魚的肝細胞中能夠導致DNA損傷，有彗星現象，但是不能在紅細胞中發生。彗星實驗還證明，殺蟲劑馬拉硫磷的主要代謝物馬拉氧磷和它的異構體對人血細胞的DNA損傷作用存在劑量-效應關系[29]。

4 結語

通過對氧化損傷與遺傳毒性的生物學指標的全面評價和綜合分析，發現檢測這些指標是毒理學領域的研究重點，因此新技術、新方法不斷涌現，并且在毒理學研究中得到成功應用，尤其是單細胞凝膠電泳檢測法的應用。因此，在環境、醫學等眾多領域，需要開發選擇性專一和靈敏度高的檢測氧化損傷與遺傳毒性的生物學指標方法

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General Situation of Research on Oxidative Damage and Genetic Toxicity Detection

LV Hui-ping, ZHU Qi

(Department of Chemistry and Chemical Engineering, Heze University, Heze, Shandong 274000)

The molecular toxicology evaluation methods on oxidative damage and genetic toxicity were reviewed. The research status of biological indicators(ROS, SOD, CAT, POD, GST, MDA, DNA damage) in the field of toxicology were introduced and discussed, focusing on the application of Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) in the detection of genetic toxicity.

ROS; POD; GST; MDA; SCGE

呂惠萍(1985- )，女，甘肅靖遠人，助教，碩士，從事化學方面的研究。

2015-03-30

R 394.6

A

0517-6611(2015)14-007-03