海藻酸鈉濃度對新型神經組織工程支架結構與性能的影響

張 琨， 馬珊珊， 孟 楠， 邢 衢， 石振慶， 關方霞

(1.鄭州大學 生命科學學院 河南 鄭州 450001；2.鄭州大學 第一附屬醫院 河南 鄭州 450052)

海藻酸鈉濃度對新型神經組織工程支架結構與性能的影響

張 琨1,2， 馬珊珊1， 孟 楠1， 邢 衢1， 石振慶1， 關方霞1,2

(1.鄭州大學 生命科學學院 河南 鄭州 450001；2.鄭州大學 第一附屬醫院 河南 鄭州 450052)

探討海藻酸鈉溶液的濃度變化對藻酸鹽水凝膠新型組織工程支架結構與性能的影響.在氯化鈣溶液濃度相同的條件下，改變海藻酸鈉溶液的濃度，制備出不同原料配比的藻酸鹽水凝膠，冷凍干燥后于光學顯微鏡下觀察其微觀結構變化，測定水凝膠的含水率與凝膠質量分數；將無菌的海藻酸鈉溶液及間充質干細胞混合后，與氯化鈣溶液反應得到包載干細胞的藻酸鹽水凝膠，倒置熒光顯微鏡下觀察水凝膠所釋放出細胞的存活情況.在氯化鈣濃度一定的條件下，隨著海藻酸鈉濃度的減小，水凝膠的空間網絡結構由致密變得疏松，更易于細胞的生存與釋放.實驗表明，海藻酸鈉水凝膠作為組織工程支架，用于神經損傷后修復具有較好的應用前景.

海藻酸鈉； 氯化鈣； 臍帶間充質干細胞； 神經組織工程支架

0 引言

脊髓損傷(spinal cord injury)是一種常見的中樞神經系統損傷，具有高發性、高致殘性、高耗費性和低齡化的特點，為世界性臨床醫學難題[1].外源性干細胞治療脊髓損傷頗具前景，然而，對于所移植干細胞的存活與分化還缺乏有效的控制[2].如何構建神經組織工程支架、獲得適宜的干細胞微環境是再生醫學面臨的一大挑戰.水凝膠作為一種具有三維網狀結構、含水量較大的聚合物/液體二元體系，其良好的機械性能、生物相容性和生物降解性，可以模仿天然的細胞外基質，用于功能分子或細胞的載體促進組織修復[3].海藻酸鈉是從褐藻中提取的水溶性聚醛酸，具有良好的生物相容性，有利于神經軸突的生長和細胞的遷移.海藻酸鈉水凝膠包載細胞的研究始于1980年，包載Schwann細胞能夠促進損傷處的功能恢復與神經再生[4].Keren等研究發現，經改性的海藻酸鈉水凝膠有利于干細胞的分化[5].海藻酸鈉水凝膠聯合膠質細胞源性神經營養因子，有助于促進神經功能的恢復[6].然而，適宜的結構(如孔徑尺寸)是促進組織再生的關鍵[7]，因此，本研究通過海藻酸鈉的濃度變化，探討海藻酸鈉水凝膠的交聯程度對其結構與生物學性能的影響，為獲得適宜的組織工程支架進行神經修復與重建提供實驗依據.

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 水凝膠的制備與微觀結構的表征

固定氯化鈣溶液為25 mmol/L，采用去離子水，分別配置濃度為0.125%，0.25%，0.5%，1%，2%的海藻酸鈉溶液.將海藻酸鈉和CaCl2以一定的比例混合，凝膠化反應后制成水凝膠.將凝膠放入-20 ℃冰箱12 h后移入-80 ℃冰箱，放置12 h后使用冷凍干燥機充分干燥，在光學顯微鏡下觀察不同水凝膠改造后的微觀結構.

1.3 水凝膠含水率、凝膠質量分數的測定

取不同濃度的海藻酸鈉溶液0.5 mL到EP管中，再分別加25 mmol/L的氯化鈣0.5 mL進行反應.待凝膠化完全后，取出上清液并測出體積，計算得到凝膠的體積.稱量得出凝膠的濕重.將凝膠冷凍干燥后，稱重，得出凝膠干重.分別代入含水率、凝膠質量分數計算公式求出含水率與凝膠質量分數.

設定凝膠體積v，凝膠的濕重m′，凝膠的干重m″，含水率s，凝膠質量分數p.則含水率與凝膠質量分數的計算公式分別為： s=((m′-m″)/m′)×100% ， p=(m″/v)×100% .

1.4 臍帶間充質干細胞從水凝膠中的釋放與存活

取培養至第3代的臍帶間充質干細胞，消化后調整細胞密度為1×105個/mL，在DMEM/F12培養基中加入10%的FBS配置完全細胞培養基，用于臍帶間充質干細胞的培養.選用DMEM/F12培養基配置濃度為0.125%，0.25%，0.5%，1%，2%的海藻酸鈉溶液，用0.22μm濾膜過濾除菌后分別與細胞懸液混合，再與無菌氯化鈣溶液反應生成包載間充質干細胞的水凝膠.待凝膠形成后棄去上清液，加入新的細胞培養液，于5%CO2的細胞培養箱中37℃孵育12小時后換取新的培養液，1天后進行結晶紫染色，采用倒置熒光顯微鏡觀察水凝膠中細胞的釋放與存活.

2 結果

2.1 海藻酸鈉濃度對水凝膠機械性能的影響

上式中Y為被解釋變量，X為解釋變量，i為樣本個數，隨機擾動項μ代表著那些對Y有影響但又未納入模型的諸多因素的綜合影響。為了使對模型的估計具有良好的統計性質，對無法直接觀測的隨機擾動項的分布，需要進行以下一些基本假定：

2.1.1 水凝膠微觀結構隨海藻酸鈉濃度的變化 將不同海藻酸鈉濃度下制備的水凝膠進行冷凍干燥后，通過光學顯微鏡對其形態進行觀察，所得結果如圖1所示.結果顯示，海藻酸鈉水凝膠具有“蛋盒”狀結構[4]，隨著海藻酸鈉濃度的增加，形成的水凝膠更加規則且結構致密，相反，海藻酸鈉濃度低的凝膠結構規則性變小且薄而稀疏.

2.1.2 水凝膠含水率和凝膠質量分數隨海藻酸鈉濃度的變化 通過對不同水凝膠進行含水率及凝膠質量分數的測定與計算，得到5組的含水率與凝膠質量分數，結果如表1所示.從表中每組實驗數據的結果來分析，海藻酸鈉水凝膠的含水率和凝膠質量分數均受海藻酸鈉的濃度影響.當鈣離子濃度不變的情況下，海藻酸鈉的濃度越大時，形成的凝膠的含水率越低，而凝膠質量分數越大.這進一步說明，在一定的鈣離子濃度下，海藻酸鈉的濃度越大，形成的凝膠越致密.

2.2 海藻酸鈉濃度對水凝膠細胞相容性的影響

在氯化鈣濃度固定為25 mmol/L條件下，選用海藻酸鈉質量分數為0.125%，0.25%，0.5%，1%，2%，制備包載臍帶間充質干細胞的水凝膠，在細胞培養箱內培養1天后的結果如圖2所示.由熒光顯微鏡下的圖片可以發現，在海藻酸鈉質量分數為0.125%，0.25%，0.5%時，水凝膠釋放出大量的貼壁細胞，而0.125%海藻酸鈉溶液獲得的水凝膠所在孔板處的貼壁細胞數量最多；當質量分數增大到1%、2%時，貼壁細胞的數量明顯逐漸減少.結果表明，在氯化鈣濃度不變的條件下，海藻酸鈉的質量分數變化會影響水凝膠的微觀結構，進而影響所包載臍帶間充質干細胞的活性.

3 討論

海藻酸鈉具有良好的生物相容性和生物降解性，在溫和的條件下，易與二價陽離子發生離子交換從而經由外部凝膠化途徑形成水凝膠[8].實驗中采用的是最常用的控制變量法，保證其他一切變量相同，只改變海藻酸鈉的濃度進行反應.在制備水凝膠過程中，測出凝膠的體積、濕重，并將凝膠冷凍干燥后稱得干重，得到了凝膠的含水率和凝膠質量分數的變化結果，發現凝膠的含水率隨著海藻酸鈉濃度的減小而增大，凝膠的質量分數隨著海藻酸鈉的濃度減小而減小.這是由于實驗中所選用的鈣離子濃度一定的條件下，隨著海藻酸鈉溶液的加入，鈣離子逐漸將鈉離子置換出來，并交聯形成三維空間網絡.同時，在海藻酸鈉與氯化鈣溶液等體積加入的情況下，隨著海藻酸鈉濃度的增大，參與反應的鈣離子增多，因此所形成的凝膠結構會越發致密[9]，該結果從微觀結構的圖片可以得到印證.因此，越多的海藻酸鈉分子經離子交聯形成水凝膠，則凝膠質量分數就會越大；由于海藻酸鈉溶液的體積一定，因此，隨著海藻酸鈉濃度的增大，凝膠質量分數增大，而含水率減小.

實驗中選用不同海藻酸鈉濃度制備包載臍帶間充質干細胞的水凝膠，在細胞培養箱內培養1天后發現，海藻酸鈉濃度的變化會影響水凝膠包載臍帶干細胞的活性.其中隨著海藻酸鈉濃度的降低，水凝膠所釋放出的細胞在孔板處的貼壁數量逐漸增多，以0.125%時的貼壁細胞數量最多.這是由于在細胞培養實驗中，隨著培養時間的延長，離子交聯網絡中的鈣離子擴散到周圍培養基中，使得水凝膠交聯網絡結構發生降解[10]，細胞得以釋放，而氯化鈣溶液的濃度比重越低，水凝膠網絡的降解會更快，細胞則更容易釋放出來.

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[3] Sudhakar C K，Nitish U，Ankush J，et al．Nanotechnology Applications for Tissue Engineering[M]．Atlanta:Elsevier,2015，77-94．

[4] 王海寶，馬學強．雪旺細胞-海藻酸鈣凝膠移植對大鼠脊髓損傷后神經絲蛋白表達的影響[J]．中醫正骨，2008，20(6)：1-3．

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(責任編輯：王浩毅)

Effect of Sodium Alginate Concentration on the Structure and Properties of a New Scaffold for Nerve Tissue Engineering

ZHANG Kun1,2，MA Shanshan1，MENG Nan1，XING Qu1，SHI Zhenqing1，GUAN Fangxia1,2

(1.SchoolofLifeScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China; 2.FirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

To investigate the influence of the different sodium alginate concentration on the structure and property of hydrogel as scaffold for tissue engineering. With the same concentration of calcium chloride solution, different concentration of sodium alginate solution was mixed to prepare different types of hydrogels. The water content of hydrogel and gel mass fraction were determined, and their freeze dried microstructure changes were observed under the optical microscope.To obtain the hydrogel loading mesenchymal stem cells,the sterile sodium alginate solution and stem cells were mixed and reacted with calcium chloride solution. Then the survival cells released from the different hydrogels were observed using an inverted fluorescence microscopeation. Under the condition of certain concentration of calcium chloride, the network structure of hydrogel was becoming looser and easier for stem cells to survive and release, with the decrease of the concentration of sodium alginate. It could be concluded that sodium alginate hydrogel as tissue engineering scaffold had a good prospect for nerve injury repair application.

sodium alginate； calcium chloride； umbilical cord mesenchymal stem cells； nerve tissue engineering scaffold

2015-09-17

河南省博士后科研項目，編號2014020.

張琨(1985—)，女，河南睢縣人，講師，博士，主要從事生物醫學工程研究，E-mail:zhangkun@zzu.edu.cn；通訊作者：關方霞(1969—)，女，河南澠池人，教授，博士，主要從事干細胞與再生醫學研究，E-mail:guanfangxia@126.com.

張琨，馬珊珊，孟楠，等．海藻酸鈉濃度對新型神經組織工程支架結構與性能的影響[J]．鄭州大學學報：理學版，2015，47(4)：99-102．

Q813.1，Q189

A

1671-6841(2015)04-0099-04

10.3969/j.issn.1671-6841.2015.04.019