自體骨髓干細胞移植治療重度下肢缺血性疾病的療效分析

呂曉霞張精勇陳幗玲高培顯王茂華吳學君金星

自體骨髓干細胞移植治療重度下肢缺血性疾病的療效分析

呂曉霞1張精勇1陳幗玲2高培顯1王茂華1吳學君1金星1

目的 觀察自體骨髓干細胞移植治療慢性下肢缺血的臨床療效。方法 觀察山東大學附屬省立醫院血管外科自2004年9月至2012年9月接受自體干細胞移植的下肢重度缺血患者79例，評定患者自體骨髓干細胞移植前、移植后1個月及6個月時患肢疼痛評分、踝肱指數、間跛距離的改變情況來評價臨床療效。結果 治療后1個月及6個月，患肢疼痛評分由術前的7.51 ± 1.18緩解至術后4.03 ± 1.12，3.38 ± 1.32，與術前比較差異均有統計學意義（P ＜ 0.05）。移植后1個月與移植后6個月評分比較，差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。間跛距離由術前的（65 ± 15）m，增加至術后的（165 ± 105）m，（195 ± 95）m，與術前比較差異均有統計學意義（P ＜ 0.05）。移植后1個月與移植后6個月評分比較，差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。踝肱指數由術前的0.22 ± 0.10，提高至術后的0.31 ± 0.05，0.34 ± 0.09，與術前比較差異均有統計學意義（均P＜ 0.05）。移植后1個月與移植后6個月評分比較，差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。結論 自體骨髓干細胞移植對緩解肢體疼痛，提高間跛距離，加快潰瘍面愈合療效確切。

骨髓； 干細胞移植； 自體； 下肢； 缺血； 動脈閉塞

下肢動脈缺血性疾病嚴重影響患者生活質量，威脅老年人的生命健康。隨著我國逐漸進入老齡社會，以及人們飲食生活習慣的改變，下肢動脈缺血性疾病的發病率越來越高。周圍動脈閉塞性疾病患病率為每年500 ～ 1 000/百萬［1-2］，其中4.3%～ 9.6%最終發展為嚴重肢體缺血，最后導致截肢［3］。藥物治療、介入治療和動脈搭橋手術是下肢動脈慢性缺血性疾病的主要治療方法。許多存在靜息痛的重度下肢動脈缺血患者，已經喪失動脈搭橋和介入治療條件，藥物治療效果不理想，仍沒有滿意的治療方法。我院血管外科依據骨髓干細胞具有高度增殖并分化為體內各種細胞的潛能，移植后能夠提供各種成血管細胞因子，促進血管生成的原理，應用自體骨髓干細胞移植技術治療79例慢性下肢缺血疾病患者，取得滿意療效，總結報道如下。

資料與方法

一、一般資料

下肢動脈慢性缺血性病變無動脈搭橋術或介入治療適應證并愿意接受干細胞移植的患者79例，男51例，女28例，年齡在33 ～ 83歲之間，平均年齡67歲。其中下肢動脈硬化閉塞癥49例，血栓閉塞性脈管炎9例，糖尿病足21例。其中12例曾行介入治療，2例曾行動脈搭橋治療。全部患者均有足部和（或）下肢發涼、麻木、間歇性跛行、靜息痛，11例患者存在足趾潰瘍，8例患者存在足趾壞疽。輔助檢查：79例患者均經下肢血管彩色多普勒、CT血管成像和（或）動脈造影檢查，股淺動脈、股深動脈存在長段狹窄或者閉塞72例，腘動脈狹窄或者閉塞66例，79例均存在脛前動脈、脛后動脈和腓動脈廣泛狹窄或者閉塞。

二、方法

（一）納入標準

（1）行數字減影血管造影、CT血管造影顯示患肢膝下動脈廣泛狹窄或閉塞；（2）無法行搭橋手術及介入治療；（3）經藥物治療，患肢靜息痛不能明顯緩解；（4）所有患者均經醫院倫理委員會討論通過，簽署知情同意書。排除標準：存在血液系統疾病、惡性腫瘤、嚴重心肺腦等臟器功能不全等。

（二）病情評估

全部患者分別于移植前、移植后1個月，6個月，通過患肢疼痛評分、踝肱指數、間跛距離對患肢缺血程度進行評價；疼痛評分：按患肢靜息痛程度分別記為0 ～ 10分，0分為無痛，10分為最劇烈疼痛。踝肱指數測定：移植前、移植后1個月、6個月測量患肢踝肱指數；間跛距離測定：移植前、移植后1個月、6個月測量患肢踝肱指數。

（三）移植方法

1.術前骨髓評估：移植前進行骨髓像評估，術前先抽取0.1 ml做骨髓涂片以排除血液病，本組發現3例骨髓增殖減低，應用粒、單核細胞集落刺激因子，4 d后復查明顯好轉。單個核細胞的獲得：患者取俯臥位，床旁心電監護。取雙側髂后上棘為骨髓穿刺點，常規消毒，鋪洞巾，1%的利多卡因行穿刺部位局部麻醉。穿刺的合適深度為骨穿針被髂骨固定，抽取骨髓時，先抽取1 ml肝素鹽水再抽取9 ml的骨髓血。使用多側孔骨髓穿刺針，多點多方向抽取，可以抽取更多的骨髓血。抽取自體骨髓血300 ～ 400 ml，貼壁注入無菌骨髓血保養袋中，混勻。在體外經過人間充質干細胞分離液處理，離心后提取單個核細胞層，分離的單個核細胞計數為（0.038 ～ 8.6）× 108個。

2.干細胞鑒定：對分離的骨髓干細胞進行鑒定，對所獲得的細胞進行表面標志，流式細胞儀分析具有：HMSC獨特的表型特征，即CD29、CD44陽性和CD34、CD45陰性。表達的細胞比率分別為CD29（94.3%），CD44（94.3%）和CD34（1.7%），CD45（0.9%）。

3.干細胞移植：硬膜外麻醉，根據CT血管造影，在動脈閉塞近端約5 cm處開始注射，一直注射至足部。注射點用記號筆標記。注射點沿主要血管走行區域縱向線型排列，一般患肢內、外側，足背、足底各3列，上下每兩點之間間隔約1 cm，兩排之間間隔1.5 ～ 2 cm，注射量為0.5 ml/穿刺點，患者所需注射液總體積為注射針數× 0.5 ml，以生理鹽水將提取的干細胞稀釋至所需注射液量。注射深度要注射入患肢肌肉層內，依胖瘦不同約為皮下1 ～ 2 cm，注射后以無菌紗布，彈力繃帶加壓包扎。術后1 ～ 2 d出院。

4.隨訪情況：患者出院前，術后1個月、6個月、12個月門診隨訪，記錄患者的疼痛評分，踝肱指數，間跛距離，并觀察患肢皮膚潰瘍愈合情況。

三、統計學分析方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，疼痛評分、間跛距離和踝肱指數均以±s表示，移植前后觀察指標的對比，使用自身配對資料的t檢驗，以P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

結　果

1.隨訪結果：所有患者均接受臨床隨診，無脫漏，隨訪6 ～ 18個月，平均12個月，移植過程中以及移植后均無嚴重并發癥發生，所有患者隨訪期間無死亡。

2.臨床效果：患者觀察指標評分：治療后1個月及6個月，患肢疼痛評分由術前的7.51 ± 1.18緩解至術后4.03 ± 1.12，3.38 ± 1.32，與術前比較差異有顯著性意義（P ＜ 0.05）。移植后 1個月與移植后6個月評分比較，差異無顯著性意義（P ＞ 0.05）。間跛距離由術前的（65 ± 15）m，增加至術后的（165 ± 105）m，（195 ± 95）m，與術前比較差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。移植后1個月與移植后6個月評分比較，差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。踝肱指數由術前的0.22 ± 0.10，提高至術后的0.31 ± 0.05，0.34 ± 0.09，與術前比較差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。移植后1個月與移植后6個月評分比較，差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。

術后第1天患者均反映患肢不適感好轉，靜息痛減輕。術后1個月57例（72.2%）患者靜息痛消失或明顯減輕，冷感減輕。11例伴有潰瘍的患者，移植后1個月潰瘍完全愈合3例，潰瘍創面明顯縮小5例，無明顯變化3例，有效率72.7%；移植1年后肢體潰瘍愈合7例，潰瘍創面明顯縮小2例，無明顯變化2例，有效率為81.8%。8例足趾壞疽患者中，3例癥狀明顯緩解，靜息痛消失，行壞疽足趾切除，愈合良好；4例疼痛消失，壞疽邊界清楚，等待壞疽組織自行有脫落；1例于膝下截肢。

本組病例中有11例于術后3 ～ 6個月癥狀出現反復。3例表現為晚間患肢麻木、怕冷，但無明顯疼痛；4例表現為跛行距離恢復至術前水平，繼續應用藥物治療；4例再次出現靜息痛，其中3例再次給予自體干細胞移植，靜息痛消失；1例行膝下截肢手術，術中發現殘端血運豐富，術后創面愈合良好。

討　論

2002年，國際上首次報道了骨髓單個核細胞移植治療下肢動脈缺血性疾病的臨床應用［4］。2004年，Gu等［5］首次報道了在國內將骨髓間充質細胞應用于下肢缺血性疾病中取得良好效果，隨后國內多家醫院將此項治療技術應用于臨床工作并進行報道［6-7］。

隨著干細胞研究的深入及其分離技術的發展，用干細胞移植治療下肢缺血性疾病使很多患者受益。目前研究表明，成體干細胞具有多分化潛能，可分化為血管內皮細胞，進一步分化形成新生毛細血管。自體干細胞移植正是利用這一原理，將干細胞移植到缺血的肢體肌肉中，使其分化、形成新生毛細血管，改善和恢復下肢血流，達到治療下肢缺血的目的。

骨髓干細胞移植治療下肢缺血性疾病的機制可能與以下因素有關［8］：（1）分泌促血管生成因子促進缺血壞死區域血管網絡重建；（2）體外細胞培養時多種骨髓源性干細胞可被誘導分化為內皮細胞或平滑肌細胞，干細胞可能作為細胞材料參與血管壁的組成；（3）通過旁分泌途徑促進側支循環的建立，并能擴大動脈內徑改善有效的血液灌注；（4）抑制組織凋亡。實驗也證實了干細胞移植通過抑制下肢缺血壞死組織的細胞凋亡、促進血管形成、減小潰瘍面積等機制參與改善下肢血運功能。

另一個值得注意的現象是，雖然所有研究均報道取得良好效果，但是不同的研究所移植的單個核細胞數量卻明顯不同。在骨髓單個核細胞移植的報道中，抽取的骨髓量介于80 ～ 1 000 ml，獲取的單個核細胞從0.1 × 109至34 × 109數量相差懸殊［4，9-10］。本組病歷每例患者抽取自體骨髓血300 ～ 400 ml，分離的單個核細胞計數為（0.038 ～ 8.600）× 108個，患者均取得較好的治療效果，表明干細胞移植在一定干細胞數量級范圍內均可以達到治療效果，移植的干細胞數量與肢體缺血的治療效果之間的關系還需要更加深入地進行研究。

本組資料發現，自體干細胞移植能夠明顯緩解患者下肢缺血癥狀，尤其能夠緩解患者靜息痛。術后第1天患者均反映患肢不適感好轉，靜息痛減輕。術后1個月72.2%的患者靜息痛消失或明顯減輕，冷感減輕。疼痛評分術前與術后1個月，6個月比較差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。靜息痛是下肢缺血患者的巨大痛苦，嚴重影響患者的生活質量，影響患者睡眠、飲食，進而誘發心腦血管疾病，威脅患者生命。干細胞移植通過緩解患者靜息痛，能夠明顯提高患者的生活質量，延長患者的壽命。但在對比自體干細胞移植術后6個月與1個月的觀察指標發現，雖然疼痛評分，踝肱指數以及間跛距離均有改善，但兩者之間比較均沒有顯著性差異，說明自體干細胞移植1個月后，患肢血運改善處于比較穩定的狀態，隨時間延長，自體干細胞并沒有進一步明顯改善患肢的缺血狀況。本組病例數量較少，隨訪時間不足，還應當進一步增加病例數量及隨訪時間，明確自體干細胞移植改善患肢血運效果與時間的關系。

本組病例中有11例于術后3 ～ 6個月癥狀出現反復，其中3例出現靜息痛的患者再次給予自體干細胞移植，靜息痛消失。筆者認為自體干細胞移植創傷小，對部分1次移植后效果不滿意或癥狀出現反復的患者，可以再次進行自體干細胞移植，多能明顯改善患者癥狀。

下肢動脈缺血患者多為老年人，本組患者平均年齡67歲，多合并心腦血管疾病，在抽取患者骨髓血時，需要對患者進行心電監護，同時靜脈補充液體，防止抽取骨髓血過程中，患者血容量短時間內減少，造成患者不適，誘發心腦血管意外。一般抽取骨髓血300 ～ 400 ml，提取干細胞后利用生理鹽水將干細胞稀釋至所需液體量。注射干細胞時，每注射點注射干細胞液0.5 ml，注射深度應為1 cm左右，在肢體消瘦的患者注射時，可以斜行注射，注射針頭稍停頓后再退出，注射后應用紗布稍作按壓，防止干細胞液反流出體外，造成干細胞液浪費。干細胞移植完成后，應利用彈力繃帶適當加壓包扎，更好的利于干細胞吸收。

基礎和臨床研究均表明，干細胞移植治療動脈缺血性疾病療效是肯定的［5，11-12］，綜合本臨床觀察結果提示，自體骨髓干細胞移植能夠明顯緩解肢體疼痛，同時增加踝肱指數，提高間跛距離，且未發現明顯副作用。相信隨著自體骨髓干細胞移植研究的深入，將為喪失手術和介入治療機會的重癥下肢動脈缺血性疾病治療開辟新的天地。

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Efficacy of autologous bone marrow stem cell transplantation in treatment of lower limbischemia

Lyu Xiaoxia1， Zhang Jingyong1， Chen Guoling2， Gao Peixian1， Wang Maohua1，Wu Xuejun1， Jin Xing1.1Department of Vascular Surgery， Provincial Hospital affiliated to Shandong University， Jinan 250021，China；2Medstar Georgetown University Hospital， Washington DC 20007， USA

Zhang Jingyong， Email： zhangjingyongys@163.com

Objective To evaluate the efficacy of autologous transplantation of bone marrow stem cell （BMSC） for treating chronic ischemia of the lower limbs. Methods Totally 79 patients with chronic ischemia of the lower limb were enrolled from September 2004 to September 2012. All the patients were not suitable for surgery treatment or interventional treatment and were willing to receive autologous BMSC transplantation.The clinical outcomes of patients were assessed by pain symptom， walking ability， ankle-brachial index of the lower limbs before and 1 and 6 months after BMSC treatment. Results The pain score decreased at 1 and 6 months after transplantation compared with that before transplantation， and the difference was significant （P ＜ 0.05）.There was no significant difference in pain score between 1 month after transplantation and 6 months after transplantation （P ＞ 0.05）. Ankle-brachial index was significantly increased at 1 and 6 months when compared with that before transplantation，and the difference was significant （P ＜ 0.05）. There was no significant difference between 1 month and 6 months after transplantation （P ＞ 0.05）. The walking distances was significantly increased at 1 month and 6 months， and there was significant difference of walking distancewhen compared with that before transplantation （P ＜ 0.05）. There was no significant difference between 1 months and 6 months after transplantation （P ＞ 0.05）. Conclusion Autologous BMSC transplantation was effective in terms of pain and walking distance， and can promote wound healing in patients with chronic ischemia of the lower limbs.

Bone marrow； Stem cell transplantation； autologous； lower limb；ischemia； artery occlusion

2015-03-09）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.04.003

250021 濟南，山東大學附屬省立醫院血管外科1；20007，美國華盛頓哥倫比亞特區喬治城大學醫院移植外科2

張精勇，Email： zhangjingyongys@163.com