分子印跡技術在農獸藥殘留檢測中的應用

文│何叢薇 王姣姣 趙春娟 高文惠（河北科技大學生物科學與工程學院）

分子印跡技術在農獸藥殘留檢測中的應用

文│何叢薇 王姣姣 趙春娟 高文惠（河北科技大學生物科學與工程學院）

一、引言

分子印跡技術（MIT）是指把某一個特定的目標分子作為模板分子，制備對該目標分子具有特異選擇性聚合物的過程，通常被定義為制備與識別“分子鑰匙”的“人工鎖”的技術。MIT是將要被分離的目標分子作為模板分子，通過交聯劑和引發劑的作用，在聚合物的單體溶液中聚合得到單體-模板分子復合物，然后除去模板分子，便得到“印跡”了目標分子的空間孔穴的分子印跡聚合物（MIPs），聚合物中就留下了空間大小、形狀及功能基團與印跡分子匹配的“記憶”，這樣的空穴對模板分子具有選擇性。MIT起源于20世紀40年代，直到1993年Vlatakis等在Nature上發表了有關茶堿分子印跡聚合物的報道后，才因為它的通用性和立體專一識別性的特點，引起了許多科研工作者的興趣。分子印跡聚合物具有選擇性較高、耐受能力強、穩定性較好、使用壽命長、應用范圍廣等眾多特點，越來越受到人們的青睞。

近年來，分子印跡技術已廣泛應用到環境保護、藥物研發、生物技術及食品安全等領域，并顯示出廣闊的前景。隨著人們健康意識的增強，對于食品和飼料中農獸藥的殘留問題日益關注。目前國內外對食品和飼料中農獸藥殘留限量的要求越來越低，因此我們需要尋找選擇性好、靈敏度高、操作簡單快速、成本低且高效可靠的檢測技術來適應農獸藥殘留檢測技術的發展，由于分子印跡技術的特點順應了農藥獸藥殘留檢測技術的發展趨勢，因此在農藥獸藥殘留檢測領域有很廣闊的應用前景。

二、分子印跡技術的應用

1.MIT在色譜分離中的應用。MIT在色譜分離技術中的應用最重要的是將MIPs用于色譜固定相。其應用涉及高效液相色譜（HPLC）、薄層色譜（TLC）、毛細管電色譜（C E C）和超臨界流體色譜（SFC）。

高效液相色譜具有分離效能高、分析速度快、靈敏度高和分析范圍寬等優點而廣泛用于生化、食品分析和藥物分析等領域。李莉等在2007年以磺胺甲噁唑為模板分子，利用原位聚合法制備了具有特定識別性能的棒狀分子烙印聚合物。將它作為高效液相色譜的固定相實現了磺胺甲噁唑與其結構類似物的分離?；前芳讎f唑烙印聚合物與目標分子間的相互作用除了有特異性的氫鍵作用外，還存在著疏水作用。本試驗還考察了含水量和流速對其分離的影響，同時論證了分子烙印聚合物選擇性專一的作用原理。結果表明，這種棒狀分子烙印聚合物對模板分子及其類似物有很好的分離能力。

薄層色譜是用于化合物快速分離和微量物質半定量分析的一種實用技術，具有操作簡單、分析快速和應用廣泛等優點。R.Suedee等利用薄層色譜，制備了偽麻黃堿與去甲麻黃堿的分子印跡聚合物作為手性固定相，并用制備的手性固定相對腎上腺素類藥物（偽麻黃堿，麻黃素，去甲麻黃堿和腎上腺素）的對映體的分辨率進行了研究。在分子印跡聚合物的制備中，甲基丙烯酸和衣康酸作為功能單體，甲醇或乙腈作為流動相，并且研究了流動相中乙酸含量的影響?；谟靡驴邓嶙鳛楣δ軉误w的去甲麻黃堿的分子印跡聚合物，用含有1%乙酸的甲醇流動相，去甲麻黃堿的手性分離獲得最好的分辨率。這些MIPs能夠分析對應于印跡分子化合物的外消旋體的結構。結果表明，基于這種MIPs的薄層色譜能作為一種分離方法成功分離腎上腺素類藥物的對映體。該方法為光學活性化合物的質量控制提供了一種快速、靈敏和可靠的方法。

2.MIT在固相萃取中的應用。固相萃取技術具有操作簡單、價格便宜、吸附容量大、易與檢測儀器聯用等優點，而基于分子印跡聚合物作為吸附劑的分子印跡-固相萃?。∕ISPE）是一種比傳統固相萃取技術更高效和高特異性的技術。采用分子印跡聚合物作為固相萃取技術的填料，其識別能力可以在識別目標物的同時，除去大部分干擾，方便儀器分析，因此成為農獸藥分析的重要手段。

楊磊以四環素作為模板分子，丙酮-十二醇-聚乙二醇作為溶劑，α-甲基丙烯酸（MAA）作為功能單體，用乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）和三羥甲基丙烷三丙烯酸酯（TMPTA）作為交聯劑，最終制備了分子印跡有機整體柱，并將它作預柱使用，對奶粉樣品中的四環素類抗生素進行了凈化與富集。在優化的在線固相萃取條件下，凈化、富集效果很好，對鹽酸土霉素、四環素，美他環素的加標回收率均大于84.2%，富集倍數分別為18.9、19.3、17.8，檢出限分別為9.25、8.48、11.74克/千克，定量限為30.8、28.3、39.1克/千克。該試驗實現了分子印跡有機整體柱作為預柱使用來與高效液相色譜聯用測定奶粉樣品中痕量四環素類抗生素的殘留。

劉博等建立了分子印跡固相萃取-高效液相色譜法檢測飼料中聯苯三唑醇。采用本體聚合法自制聯苯三唑醇分子印跡聚合物，并以此聚合物為固相萃取劑，對飼料樣品中聯苯三唑醇進行了分離富集。利用高效液相色譜法測定其在飼料中的殘留情況。結果表明：該方法線性范圍為1～200微克/毫升，檢測限為0.5微克/毫升，平均回收率為76.4%～89.0%。

高文惠等利用虛擬模板分子印跡固相萃取技術對食品中的聯苯三唑醇與烯唑醇進行了分離富集，并建立高效液相色譜檢測方法。以腈菌唑為模板分子，丙烯酰胺為功能單體，EDMA為交聯劑，乙腈為致孔劑，采用本體聚合法制備得到了腈菌唑分子印跡聚合物，以此聚合物為固相萃取劑，制備固相萃取柱，對食品中聯苯三唑醇和烯唑醇進行分離富集，并采用高效液相色譜法測定其在食品中的殘留。采用C18色譜柱分離，以甲醇-水（體積比為90∶10）溶液為流動相，紫外檢測波長為210納米，外標法定量。結果表明，聯苯三唑醇和烯唑醇的平均回收率分別為89.40%～90.88%和81.37%～83.26%，相對標準偏差（RSD）分別為1.08%～2.04%和1.29%～2.52%，檢測限均為0.20微克/克。此聚合物對兩種殺菌劑具有良好的吸附能力，擬模板分子印跡固相萃取技術可以用于這兩種殺菌劑的分離檢測。

胡靜等建立了分子印跡固相萃取-高效液相色譜法檢測食品中兩種三唑類殺菌劑殘留的方法。分別以三唑醇、烯唑醇為模板分子，MAA為功能單體，EDMA為交聯劑，采用本體聚合法合成分子印跡聚合物。將制得的三唑醇、烯唑醇聚合物按質量比1∶1混合，制成固相萃取柱用于樣品的前處理，并采用高效液相色譜法檢測。結果：在低和高濃度添加水平下，平均回收率在78.7%～94.3%之間，RSD在1.8%～2.4%之間（n＝5）。結論：該方法靈敏度高，精密度好，適合于同時檢測食品中三唑醇和烯唑醇兩種三唑類殺菌劑殘留。

魏艷玲等建立了基于分子印跡固相萃取-高效液相色譜同時測定雞血漿中環丙氨嗪和三聚氰胺的殘留方法，實現了用離子對反相高效液相色譜紫外同時分析檢測，環丙氨嗪和三聚氰胺在0.10～10.0微克/毫升范圍內線性關系良好，雞血漿中三聚氰胺和環丙氨嗪的回收率均高于70%，RSD＜10%，檢出限達0.05微克/毫升，為血漿等復雜基質中二者的同時測定提供了一種高選擇性、高效和靈敏的分析方法。

肖琴等將分子印跡固相萃取和高效液相色譜法聯用，建立了一種檢測魚肉中孔雀石綠和結晶紫及其代謝產物殘留的新方法。該方法對魚肉樣品的回收率為97.06%～111.83%，RSD為1.54%～10.49%。他建立的新方法簡單快速、準確可行，而且有機溶劑用量少，被成功地用于魚肉中孔雀石綠和結晶紫及其代謝產物殘留的測定。

3.MIT在膜分離中的應用。分子印跡膜將膜分離的可連續化操作與MIPs的高選擇性相結合，合成的具有分子識別功能的薄膜將是功能材料研究領域中一個重要的發展方向。目前制備的分子印跡膜主要有3種：分子印跡填充膜、分子印跡整體膜和分子印跡復合膜。

Zhu等在尼龍膜表面將甲基丙烯酸作為功能單體，甲苯作為致孔劑合成了對殺蟲劑久效磷具有選擇性吸附的分子印跡復合膜，結果表明該印跡復合膜對久效磷具有較高的選擇性。L.Donato等采用光聚合法把聚丙烯平板膜作為基膜，S-蔡普生作為模板分子，4-乙烯吡啶作為功能單體，制備了S-萘普生分子印跡復合膜。試驗結果表明該復合膜對S-萘普生的選擇性吸附因子為1.6。

王靖宇采用熱聚合方法和原子轉移自由基聚合方法以萘普生和茶堿作模板分子和聚偏氟乙烯平板膜或中空纖維膜為基膜，制備了分子印跡膜。聚合后在聚偏氟乙烯基膜表面形成了一層印跡膜。用高效液相色譜系統測試分子印跡膜的分離效果，結果表明外消旋的萘普生通過分子印跡柱后的色譜圖中出現兩個峰，分別對應于S-萘普生和R-萘普生，該分子印跡體系的分離機理為促進滲透機理。

Kochkodan等在聚偏氟乙烯膜表面涂敷一層敵草凈印跡聚合物薄層制備了分子印跡復合膜，將其用于水溶液中敵草凈的選擇性分離。該膜對敵草凈具有很高的特異吸附性，水通量可達4.59升/（平方米·小時）。在對影響膜表面修飾度及膜性能的因素研究中發現，膜的修飾度預涂敷過程中膜表面引發劑的濃度和聚合時間對其有影響，聚合時間越長，修飾度越高，膜表面沉積層厚度增加，膜孔徑變小，印跡位點增多，表觀吸附量增大。

張春靜等選用多孔的醋酸纖維膜為支撐層，首先將其浸入含奎寧模板分子的氯仿溶液中30分鐘，然后在4℃氮氣氛圍中于360納米紫外燈光下聚合48小時得到分子印跡膜，該復合膜保持了醋酸纖維膜良好的通量，奎寧在該膜上結合量達到20.6微摩爾/克。試驗結果表明，多孔醋酸纖維膜具有較好的耐有機溶劑性和耐紫外光照性能，能夠使分子印跡膜獲得較大的滲透量。

4.MIT在傳感器中的應用。傳感器是由信號轉換器和識別元件兩部分構成，識別元件以某種方式位于轉換器的表面，當所檢測的目標分子與識別元件結合時，就會產生一個物理或化學信號，這時轉換器就會將此信號轉換成一個可定量的輸出信號，通過監測輸出的信號對目標分子進行實時測定。將分子印跡聚合物作為識別元件，結合不同種類轉換器而制得的分子印跡傳感器既具有生物傳感器的專一識別性，又有化學傳感器的機械穩定性、熱穩定性，因而成為傳感器領域研究的新熱點。自1987年Tabushi首次用分子印跡聚合物作為敏感材料，對維生素進行檢測之后，人們就對分子印跡聚合物傳感器產生興趣。分子印跡傳感器的應用包括光學傳感器、電化學傳感器等。

張挪威采用光聚合法在一次性絲網印刷電極上制備琥珀酸氯霉素分子印跡膜，其后將絲網印刷電極通過電極插口與電化學分析裝置相連接，組裝成檢測琥珀酸氯霉素殘留的電化學傳感器，利用與傳感裝置相連接的記錄儀記錄響應的結果。本傳感器建立了檢測氯霉素的標準曲線并測試了實際牛奶樣品中氯霉素含量的方法。電鏡觀察表明，與非印跡膜相比，在印跡膜表面形成大量直徑約為100納米的印跡微孔。本傳感器裝置檢測琥珀酸氯霉素具有很高的靈敏度和特異性，檢出限為2×10-9摩爾/升，檢測線性范圍為1×10-8～1.2×10-5摩爾/升，基于牛奶樣品的檢測回收率介于93.5%～95.5%之間。

馬永飛制備了一種對莠去津有識別特性的分子印跡膜，即在含和不含模板分子的情況下，利用循環伏安技術在金電極表面沉積2-巰基苯并咪唑，制備了2-巰基苯并咪唑聚合膜。利用循環伏安法對印跡和非印跡膜行為進行了評價，對分子印跡膜的影響因素進行了篩選和優化。試驗表明，該分子印跡膜對莠去津具有良好的選擇性和靈敏度。莠去津的還原峰電流與濃度在1.2×10-8～8.0×10-5摩爾/升范圍內具有良好的線性關系（r＝0.99862），檢出限可達3.0×10-9摩爾/升。此傳感器測定土壤中的莠去津，回收率在90.8%～98.2%之間，取得了很好的效果。

連惠婷等基于殼聚糖功能基體的電化學沉積，將久效磷作為模板分子，在玻碳電極表面直接制備具有記憶功能的分子印跡電化學傳感器。借助以氫鍵為主的弱的分子間作用力，實現久效磷在殼聚糖聚合基體內的印跡，而施加＋0.6V電壓改變復合物成鍵的微環境可以實現洗脫。對分子印跡膜性質、洗脫方式等制備條件進行考察，其后采用陽離子型電化學探針三氯化六銨合釕，研究分子印跡傳感器對久效磷的電化學響應特性。結果表明，所制備的久效磷分子印跡電化學傳感器具有較高的選擇性，對久效磷的檢測限可達0.1微摩爾/升。

劉鎮通過沉淀聚合法制備了獸藥氯霉素的分子印跡聚合物，并構建了分子印跡壓電生物傳感器，通過對檢測條件的優化，該傳感器對氯霉素具有良好的響應，且具有良好的特異性識別能力，成功應用于蝦肉和豬肝臟中氯霉素的殘留檢測，用該方法檢測蝦肉和豬肝臟中的氯霉素具有前處理簡單，設備便宜，響應時間短等優點，該方法有望在以后得到實際應用。

廉文靜等通過分子印跡技術、結合殼聚糖-碳納米管復合物和納米金構建快速檢測卡那霉素的分子印跡傳感器。用電聚合法將分子印跡聚合物聚合到金電極上，采用循環伏安法和安培法經電化學工作站檢測傳感器的電流響應。結果表明：該傳感器的檢測線性范圍為3×10-8～4×10-5摩爾/升（r＝0.988），最低檢測限為1.29×10-8摩爾/升（信噪比為3）。重復試驗的相對標準偏差為3.6%。結果證實該分子印跡傳感器具有很強的靈敏度、特異選擇性、重復性和穩定性，并在實際樣品檢測中顯示了很好的回收率（95%～102%）。

目前，印跡傳感器技術可用于莠去津、敵草凈、2，4-D、草甘膦、對硫磷、氯霉素等農藥的檢測，對大部分農藥檢測限可達微摩爾/升級。隨著分子印跡技術和微電子技術的發展，分子印跡傳感器技術將作為一種新的農藥檢測方法，具有廣闊的發展前景。

三、展望

MIT比傳統分離凈化方法具有很多優勢，但目前仍存在一些問題。結合位點的作用機理、傳質機理仍不清楚，需開展大量工作從分子水平上更好地理解分子識別過程；目前合成MIPs需使用大量模板分子，難以從根本上解決模板分子滲漏現象，限制了MIT在痕量分析中的實際應用，采用替代模板聚合法是解決此問題的有效方法；現今多數MIPs中識別位點與模板分子之間的分子間作用力以氫鍵為主。當用于生物、環境樣品等水相體系的前處理時，其識別過程會受到水等強極性溶劑干擾，在水溶液或極性溶劑中進行分子印跡和識別仍是難題。

河北省科技支撐計劃項目（10276902D），石家莊市科技支撐計劃項目（12149472A）