解毒通絡保腎法對糖尿病腎病大鼠腎小球Notch胞內域表達的影響

樸松蘭王倩涵李 蓓鄭晶晶牟美佳劉美春姜茗宸

（1 長春中醫藥大學基礎醫學院，吉林 長春 130117；2 長春中醫藥大學 護理學院2011級，吉林 長春 130117）

解毒通絡保腎法對糖尿病腎病大鼠腎小球Notch胞內域表達的影響

樸松蘭1王倩涵2李 蓓2鄭晶晶2牟美佳2劉美春2姜茗宸2

（1 長春中醫藥大學基礎醫學院，吉林 長春 130117；2 長春中醫藥大學 護理學院2011級，吉林 長春 130117）

糖尿病腎??；解毒通絡保腎法；腎功能衰竭；實驗研究

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）在臨床上以持續性蛋白尿和進行性腎功能減退并最終進展至終末期腎功能衰竭為特征，是糖尿病最常見的慢性并發癥之一。在我國，糖尿病的發病率逐年增加，目前約有4千萬人面臨糖尿病威脅，而在終末期腎功能衰竭的患者中，DN所占比例也正逐漸增高。DN不僅嚴重影響患者的生活質量，還常常危及患者生命，因此探討DN發生發展機制、找到針對DN的有效治療方法顯得非常有意義。

近年來，隨著對腎小球濾過屏障結構和功能改變的深入研究，證實足細胞損傷是糖尿病蛋白尿產生和腎小球硬化的關鍵因素，多數證據支持足細胞凋亡是糖尿病足細胞減少的主要原因，與Notch通路激活密切相關，而該通路在DN的發病、發展過程中起到重要作用［1］。目前對Notch通路的研究主要集中在腫瘤發病學和胚胎發育領域，對DN腎小球病變研究甚少。

解毒通絡保腎法是我校國家名老中醫南征教授在50多年來從事DN臨床與中醫理論研究基礎上提出的消渴腎病之治法，有很好的療效，尤其在改善蛋白尿方面效果顯著［2-3］。蛋白尿與腎小球足細胞脫落（主要是凋亡）而致的濾過膜通透性升高有密切關系，解毒通絡保腎法改善蛋白尿的作用可能與對足細胞保護作用有關，這種保護作用可能是通過對Notch通路的抑制來減少足細胞凋亡或脫落，為了驗證這個假設，進行實驗研究，具體如下：

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物：8周普通級雄性Wistar大鼠60只（體質量180～230 g），由吉林大學基礎醫學院實驗動物室提供。實驗期間大鼠自由攝食和飲水。

1.1.2主要試劑和藥品：鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）購自美國Sigma公司，解毒通絡保腎膠囊由長春中醫大學附屬醫院制劑室提供。

1.2方法

1.2.1大鼠DN模型制備方法：適應性喂養7 d后，禁食、不禁水12 h，按體質量隨機分為正常對照組10只、DN模型制作組50只。以單次、大劑量腹腔注射STZ方法制備DN模型（劑量為STZ 52 mg/kg體質量，臨用前用0.1 M枸櫞酸緩沖液溶解，溶液pH 4.2），正常對照組僅腹腔注射等體積枸櫞酸緩沖液。注射STZ 72 h后，從尾靜脈采血，檢測空腹血糖，將血糖≥16.7 mmol/L、尿糖+++以上大鼠視為DN模型制備成功。

1.2.2實驗動物分組及給藥方法：將造模成功的36只DN大鼠，按體質量、血糖隨機分為DN模型對照組、解毒通絡保腎法組和苯那普利組（西藥對照）。本實驗具體分組情況及給藥方法如下：正常對照組（10只）；DN模型對照組（12只）；解毒通絡保腎法組（12只），每日以5 g/kg體質量劑量灌胃解毒通絡保腎膠囊混懸液；苯那普利組（12只），每日以15 mg/kg體質量劑量灌胃苯那普利混懸液。正常對照組和DN模型組灌服等體積生理鹽水，連續給藥8周，每日上午1次。

1.3觀察指標：藥物干預8周末，處死動物，打開腹腔，快速取出腎臟，按冠狀面切開，迅速浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片，常溫保存。

1.3.1HE染色觀察腎臟組織結構：將切片脫蠟至水，常規HE染色、封片后光學顯微鏡下觀察。

1.3.2免疫組化方法檢測NICD腎臟表達，棕黃色染色區域為陽性：將切片脫蠟至水，SP免疫組化法染色，光鏡下觀察。

2　結 果

2.1腎臟HE染色觀察結果：正常對照組大鼠腎小球均無明顯異常，絕大部分毛細血管袢開放，血管壁正常，系膜區細胞外基質（extracellular matrix，ECM）未見明顯增多，近曲小管結構正常。DN模型組大鼠腎小球內部分毛細血管受壓而塌陷，系膜區ECM無明顯增多，所見近端小管上皮細胞高度水腫。解毒通絡保腎組和苯那普利組大部分毛細血管袢開放，系膜區ECM無明顯增多，偶見近端小管上皮細胞水腫。

2.2腎臟NICD免疫組化染色觀察結果：NICD免疫組化染色，棕黃色著色區域為陽性，細胞核表達為Notch通路活化標志。正常對照組腎小球內出現少量陽性表達，主要為胞質表達；部分腎小管上皮細胞胞質及細胞核內有棕黃色著色區域，但主要以胞質為主，細胞核表達極少。DN模型組大鼠腎小球內出現較多棕黃色著色區域，細胞核表達多見；腎小管上皮細胞核內陽性表達增多。與DN模型對照組比較，解毒通絡保腎組腎小球內細胞核陽性表達較少，腎小管上皮細胞陽性表達主要以胞質為主。苯那普利組腎小球內細胞核陽性表達亦較少，與解毒通絡保腎組表達無明顯差別。

3　討 論

Notch信號通路是一種相對保守的、廣泛存在于細胞間的信號傳導通路，該通路在細胞的增生和分化中起到了關鍵性的作用。Notch信號由受體與配體相互作用而激活，配體誘導Notch受體發生構象變化，先后在細胞外金屬蛋白酶和γ-分泌酶（γ-secretase）的作用下釋放出Notch胞內域NICD，NICD 是Notch信號的活化形式。NICD進入細胞核后，激活Notch通路下游基因Hes和Hey，從而影響細胞分化、增殖和凋亡。目前Notch信號通路在腎臟中的研究，已從腎臟的發育轉到腎小球疾病，該通路可能在足細胞的凋亡過程中起到了關鍵性作用。足細胞損傷是腎小球疾病發展的重要因素，可引起嚴重的蛋白尿。Notch信號通路的激活可能是足細胞病理損傷的一個常見機制，受損傷足細胞的最終結局依賴于Notch信號通路激活水平。足細胞數量減少會造成濾過膜對蛋白選擇通透性的喪失，發生蛋白尿，而尿蛋白的增加將誘導腎小球纖維化和腎小管萎縮。在健康的成人腎臟腎小球內幾乎檢測不到Notch活化，NICD細胞核表達是該通路激活的標志。

解毒通絡保腎法方藥選榛花、大黃為君藥，重在解毒、排毒；選黃連、雙花（清熱解毒，燥濕祛濁）和黃芪、丹參（益氣通絡，扶正抗毒）為臣藥，共同起到增強君藥的解毒作用；選生地、枸杞為佐藥，取其養陰生津、滋補肝腎之用；地龍走竄入絡為使藥。諸藥合用，共奏解毒通絡、化瘀保腎之功效。本實驗結果顯示，解毒通絡保腎法膠囊能夠改善DN大鼠腎小球和腎小管結構，減少腎小球內細胞核NICD表達。該結果提示，解毒通絡保腎法能夠抑制糖尿病腎病大鼠腎小球內Notch通路激活，更具體作用機制有待于進一步研究、探索。

［1］Niranjan T，Bielesz B，Gruenwald A，et al.The Notch pathway in podocytes plays a role in the development of glomerular disease［J］.Nat Med，2008，14（3）：290-298.

［2］何澤，樸春麗，陳曦，等.解毒通絡保腎法治療35例糖尿病腎病臨床研究［J］.中國實用中醫藥，2011，6（6）：165-167.

［3］何澤.解毒通絡保腎法治療糖尿病腎病驗案［J］.中國中醫藥現代遠程教育，2010，8（9）：65.

R587.2

B

1671-8194（2015）28-0040-02

項目受吉林省中醫藥管理局資助（2012-042）