以乙型肝炎核心病毒蛋白為載體融合金黃色葡萄球菌IsdA表位多肽的免疫原性

白 靚，成 巖，劉 燕，張樹軍，曹瑞珍

以乙型肝炎核心病毒蛋白為載體融合金黃色葡萄球菌IsdA表位多肽的免疫原性

白 靚1,2，成 巖3，劉 燕1,2，張樹軍1，曹瑞珍1

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，Saureus)，是一種最常見的條件致病菌?？梢砸鹑撕蛣游锏亩喾N類疾病，感染牛導致的牛乳房炎給奶牛產業造成巨大損失；感染人可引起皮膚和軟組織感染，嚴重者可出現肺炎、菌血癥、膿毒血癥、心內膜炎及骨髓炎[1]。Saureus中存在大量的耐藥株，尤其是耐甲氧西林Saureus，降低了抗生素療法的可靠性[2]。疫苗可以通過主動免疫或被動免疫途徑切斷感染輔助抗生素療法，但至今還沒有商品化的Saureus疫苗上市，研發競賽已在全世界范圍展開[3]。

鐵調節表面決定因子A(iron-regulated surface determinant A，IsdA)是Saureus表面蛋白中的一員，由350aa組成，功能是參與細菌對血紅素中鐵的攝取。IsdA的N-末端為鐵轉運蛋白結構域，與轉鐵蛋白、纖維蛋白原、纖連蛋白、血紅素、角質細胞的包膜蛋白等受體結合，幫助S.aureus的粘附及傳播[4]。IsdA的C-末端結構域可增強S.aureus親水性，能逃避人類皮膚分泌殺菌脂肪酸、抗菌肽的殺傷[5]。Stapleton等[6]報道IsdA215-310多肽高度保守，且使用這段表位多肽免疫小鼠后可誘導具有調理吞噬功能的保護性抗體，但產生抗體滴度較低。據此我們推斷IsdA215-310含有抗原表位，為了進一步提高IsdA215-310的免疫原性，我們嘗試使用乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus core protein，HBc)作為載體。HBc載體是將其(共183aa)N端144個aa裝配成的類病毒顆粒，外源的表位可以通過基因工程方法插入到HBc載體的N端、C端或免疫顯性區(MIR區，位于HBc76-82aa)，其中MIR區在提高外源表位免疫原性方面效果最佳[7]。Clarke等首次使用HBc作為表位載體并闡釋其優點，他們選擇口蹄疫病毒的主要抗原VP1蛋白作為研究對象，將VP1的表位放至HBc的N末端，結果顯著提高了多肽的免疫原性[8]。

本研究我們用基因工程法將IsdA215-310多肽插入到HBc的MIR區，通過大腸桿菌表達制備出融合蛋白抗原，通過小鼠免疫試驗評價其誘導抗體的水平，及對小鼠的免疫保護作用，為預防性S.aureus疫苗的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 基因、質粒與菌株 HBc(GenBank,No:429475205)，IsdA (GenBank,No:ap009351.1)；表達載體pET28b(+)、表達菌株BL21(Novagen)；大腸桿菌DH5α、Saureus(Newman株)由內蒙古民族大學生物化學與分子生物學實驗室保藏。

1.2 主要試劑與實驗動物 限制性核酸內切酶(NcoⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ)(寶生物)；DNA分子量標準D2000、MarkerⅢ，蛋白質分子量標準14.4～94.0 kDa(天根生物公司)；WB預染蛋白質分子量標準SM0671(Thermo)； HisTrap FF(GE Healthcare)； HRP標記的羊抗小鼠IgG、HRP標記的羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)；rIsdA蛋白、rIsdA多克隆抗體(兔源，1∶12 800),內蒙古民族大學生物化學實驗室制備保存；弗氏佐劑(sigma)；BALB/c小鼠，雌性，4～6周齡，購自吉林大學實驗動物中心。

1.3 基因設計與合成 依據GenBank公布序列，設計目的基因HBc-IsdA215-310，結構示意圖(圖1)。IsdA215-31095aa插入替換HBc(144aa)的第76～82位aa，共232aa，696 bp?；蛏嫌我隢coⅠ序列，下游引入XhoⅠ序列。序列由上海生工公司合成，質粒命名pUC57-HBc-IsdA215-310。

1.4 pET28-HBc-IsdA215-310載體構建與表達 對提取質粒pUC57-HBc-IsdA215-310、pET28b(+)雙酶切(NcoⅠ，XhoⅠ)。使用凝膠回收試劑盒制備載體與目的基因，并對回收產物連接、轉化，通過酶切、測序鑒定陽性克隆。提取陽性質粒pET28-HBc-IsdA215-310轉化入BL21感受態，篩選陽性克隆菌37 ℃培養，菌體OD600為0.5時用IPTG誘導，6～8 h后離心收集菌體，超聲破碎，離心收集沉淀與上清，12% SDS-PAGE。

1.5 Western blot及純化 HBc-IsdA215-310蛋白經12%SDS-PAGE電泳，轉印至PVDF膜，一抗選擇兔源rIsdA多克隆抗體(稀釋度1∶1 000)孵育過夜，洗滌后加入HRP標記羊抗兔IgG作為二抗(稀釋度1∶1 000)，DAB顯色，水洗膜終止反應，記錄結果。純化蛋白首先超聲破碎菌體，經鑒定蛋白存在上清中，收集超聲裂解液上清用0.45 μm濾膜過濾后，過HisTrap FF鎳柱，洗脫緩沖液梯度洗脫，收集樣品12% SDS-PAGE。

1.6 小鼠分組及免疫 BALB/c小鼠分為4組，每組10只，分別為HBc-IsdA215-310、HBc-IsdA215-310添加佐劑、rIsdA添加佐劑，對照組(PBS)。免疫方法采用小鼠腿部肌肉注射，免疫接種共2次，分別于0 d、11 d，劑量100 μg/只。蛋白抗原去內毒素后，第1次免疫接種使用等體積弗氏完全佐劑，第2次用弗式不完全佐劑。免疫動物的采血時間為11 d、20 d，每次隨機選取5只小鼠尾靜脈取血，進行IgG抗體效價檢測。

1.7 抗體ELISA檢測及小鼠攻毒試驗 間接ELISA法檢測血清IgG，分別取rIsdA、HBc-IsdA215-310抗原(1 mg/mL)4 ℃過夜包被ELISA板，次日置于含有BSA的封閉液中封閉反應1 h。取實驗組鼠血清按1∶100倍稀釋的初始濃度加入到ELISA板內，按倍比稀釋法稀釋，37 ℃孵育1 h，洗滌液沖洗5遍后加入HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶2 000)，37 ℃孵育反應1 h，洗滌及TMB顯色，用酶標儀在492 nm測定各孔吸光值，樣品OD值≥2.1陰性對照OD值，判定為陽性，并記錄最終效價值；攻毒試驗：取30 μL凍存的菌液接種到TSB培養基上復壯，按平板計數法測定培養基細菌數。取初次免疫后21 d小鼠(10只)，腹腔內接種2×1010CFU/只(LD50)[9]，連續觀察7 d，記錄小鼠死亡情況。

2 結 果

2.1 重組質粒載體酶切鑒定結果 pET28-HBc-IsdA215-310質粒采用XhoⅠ與XbaⅠ雙酶切后，經過瓊脂糖凝膠電泳，獲得片段約為730 bp和5 200 bp(圖2)，結果與預期一致。

2.2 重組蛋白表達、純化結果 HBc-IsdA215-310表達菌誘導前、誘導后、純化及rIsdA對照的SDS-PAGE電泳，結果在26 kDa、38 kDa左右出現目的條帶，結果與預期一致(圖3)。

M: DNA markerⅢ; 1: pET28-HBc-IsdA215-310; 2: Digested byXhoⅠandXbaⅠ.

圖2 pET28-HBc-IsdA215-310的酶切鑒定

Fig.2 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmids pET28-HBc-IsdA215-310

M: Protein molecular weight marker; 1: Unintruduced bacteria expressing HBc- IsdA215-310; 2: Intruduced bacteria expressing HBc-IsdA215-310; 3: Purified HBc- IsdA215-310; 4: Purified rIsdA.

圖3 重組蛋白表達產物的SDS-PAGE

Fig.3 Analysis of the recombinant proteins HBc-IsdA215-310 by SDS-PAGE

2.3 重組蛋白的Western blotting 分析 取rIsdA多克隆抗體作為一抗，HRP標記羊抗兔IgG作為二抗，對重組蛋白HBc- IsdA215-310及 rIsdA進行Western blotting檢測，結果顯示在26 kDa和38 kDa附近位置出現特異性條帶，與預期一致(圖4)。

M: Protein molecular weight marker; 1: HBc- IsdA215-310; 2: rIsdA..

圖4 重組蛋白的western blot 分析

Fig.4 Analysis of the recombinant proteins HBc-IsdA215-310 and rIsdA by western blot

2.4 重組蛋白HBc- IsdA215-310在小鼠體內誘導特異性抗體的檢測 間接ELISA法檢測血清特異性IgG。使用rIsdA作為包被抗原在20 d檢測IgG效價, rIsdA添加佐劑組與HBc-IsdA215-310添加佐劑組相比較(P=0.004,P<0.01)(表1)；使用HBc-IsdA215-310作為包被抗原在20 d檢測IgG效價，HBc-IsdA215-310添加佐劑組與rIsdA添加佐劑組相比較(P=0.002,P<0.01)(表2)。免疫組能誘導小鼠出現高特異性IgG抗體。

表1 rIsdA作為包被抗原檢測免疫血清特異性抗體效價值

Note: *P<0.01 compared with HBc-IsdA215-310+adjuvant.

表2 HBc-IsdA215-310作為包被抗原檢測血清特異性抗體效價值

Note:*P<0.01 compared with rIsdA+adjuvant.

2.5 攻毒實驗結果 免疫組和對照組在初次免疫后21 d開始攻毒實驗，觀察7 d。結果顯示，HBc-IsdA215-310添加佐劑組保護率70%(P=0.370)，HBc-IsdA215-310保護率60%(P=0.656)，rIsdA保護率50% (P=1.000)，PBS對照組保護率40%。各免疫組與PBS對照組相比(P>0.05)，免疫組與對照組免疫保護率差異無統計學意義(圖5)。

Fig.5 Efficacy of immunization with antigens against LD50S.aureuschallengein mice

3 討 論

隨著Saureus的耐藥株比例不斷攀升及抗生素的濫用，給Saureus感染的治療帶來巨大困難。通過疫苗接種預防Saureus感染是一種理想的治療方案。根據Saureus構建的滅活疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗、特異性單克隆抗體在臨床實驗中均以失敗告終[10]，這一結果對疫苗抗原的選擇提出了更苛刻的要求。

為了設計新型Saureus疫苗，我們選擇應用HBc為載體蛋白攜帶Saureus抗原表位，以此提高抗原的免疫原性。HBc本身具有Th表位，可以幫助產生針對外源表位的抗體；HBc與外源表位能共同組裝成直徑為36 nm大小的類病毒顆粒，有利于抗原的加工呈遞[11]；HBc還具有T細胞非依賴抗原的特征，可以直接激活B淋巴細胞產生抗體，并擁有強大的誘導針對外源表位的B、Th、CTL細胞應答的能力[12]。HBc載體的插入位置選擇靈活，可以選擇N末端，C末端及MIR區(76-82aa)，通過對HBc空間結構分析發現MIR區在誘導抗HBc抗體方面占絕對主導，將該區域替換成外源表位，可誘導出抗該表位的特異性抗體[13]。本研究選擇使用MIR區作為插入位點，利用已知的基因序列信息，通過全基因合成法直接合成出嵌合蛋白的基因，減少了抗原從設計到制備的時間。除了對插入位點的選擇外，對于外源插入表位多肽片段的長度也要加以限制，表位長度最小可以是5～15aa的B細胞表位，片段最大載量為258aa的綠色熒光蛋白片段，超出這一范圍會影響HBc的空間結構，降低免疫原性[14]。本研究使用95aa的IsdA215-310片段，對HBc的空間正確折疊影響有限。對于插入抗原的選擇，應選擇分子量大小適中，免疫原性強，高度保守性的蛋白，而IsdA符合上述條件。Stranger等[9]及Schneewind等[15]利用IsdA的抗原特征進行疫苗研究，取得理想的效果，而我們選取的IsdA215-310已被證實能誘導具有調理吞噬功能的抗體[6]。

本研究使用HBc作為載體與IsdA215-310在大腸桿菌中嵌合表達，通過Western blot分析及小鼠免疫試驗分析所表達蛋白的免疫活性，結果表明嵌合基因能夠在大腸桿菌系統中正確表達，而且表達蛋白經過分離純化可以在小鼠體內誘導出特異性的IgG抗體(效價值：20480±7010)，對完成免疫程序后的小鼠使用Newman株LD50攻毒，免疫保護率達70%，雖然比rIsdA免疫保護率(50%)高出了20%，但經Fisher精確檢驗確定(P>0.05)兩者差異不顯著；各免疫組與PBS對照組相比(P>0.05)差異不顯著。HBc-IsdA215-310免疫組對小鼠免疫保護率最高，這可能與HBc特有的結構優勢促進外源抗原表位在體內的加工與呈遞有關，而IsdA215-310中存在表位的種類與結構需要進一步的表位作圖來證實。攻毒試驗結果雖然沒有達到100%保護，但給我們提供了一個思路，下一步可以從Saureus表面蛋白中選取其抗原表位進行與此相似的實驗，制備出多亞單位聯合疫苗，提高免疫保護率。除此之外，本實驗所涉及到的攻毒菌株種類(Newman株)，使用的疫苗佐劑類型(弗氏佐劑)及實驗動物種類(BALB/c)的選擇都會對HBc-IsdA215-310抗原的免疫保護效果產生影響，進一步實驗還可嘗試使用不同毒力的Saureus進行攻毒保護實驗；使用不同佐劑優化免疫效果；更換其它種類的實驗動物進行免疫試驗。本研究為新型Saureus疫苗研究提供參考。

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美國《Emerging Infectious Diseases》2014年第11期有關人獸共患病論文摘譯

P1803 1918年智利流感大流行期間的死亡模式\ Gerardo Chowell，Lone Simonsen，Jose Flores，等

南美洲歷史性流感大流行流行病學信息的缺乏妨礙了對整個美洲大陸及不同氣候區域流行模式的完整理解。為填補1918年智利流感大流行相關的死亡時空模式的空白，我們對檔案記錄進行了回顧。我們發現的證據表明，同年不同時期有多流行波出現，1918-1921年間出現流行強度的波動，流感相關的超額死亡高峰出現在1919年7-8月。所有年齡組包括50歲以上成人，與大流行相關的死亡率均升高，年輕的成年人與基線相比升高最多?？傊?，估計智利流感大流行引起的超額死亡率為0.94%，與其他拉丁美洲國家的報告率相似，而各省率值波動相差約10倍。 大流行期間的死亡模式受宿主特異的敏感性，人口密度，基線死亡率和氣候變化的影響。

P1812 超毒力和耐多藥肺炎克雷伯菌克隆組群的基因組定義\ Suzanne Bialek-Davenet，Alexis Criscuolo，Florent Ailloud，等

耐多藥和高毒力的肺炎克雷伯菌菌株不斷涌現，但是對應于這些高危毒株的克隆組群(CGs)仍不能精確定義。我們的目標是在全基因組變異的基礎上對肺炎克雷伯菌克隆組群進行鑒定，并提供一個簡單的生物信息工具，從基因組數據中提取毒力及耐藥基因數據。我們對48株絕大多數菌株血清型為K1和K2的肺炎克雷伯菌進行了測序，并將其與119個可公開獲取的基因組進行了比較。共有694個高度保守的基因納入了核心基因組多位點序列分型計劃中，數據聚類分析使超毒力和多耐藥克隆組群全球分布情況的精確定義得以實現。此外，我們創建了BIGSdb-Kp，在這個自由開放的數據庫中能夠從肺炎克雷伯菌基因組序列快速提取相關的醫學和流行病學信息。雖然肺炎克雷伯菌耐藥和毒力種群很大程度上不重疊，仍檢出了兼有兩者特征的菌株。

P1821 2013年麥加朝圣期間朝圣者中的呼吸道病毒和細菌\ Samir Benkouiten，Rémi Charrel，Khadidja Belhouchat，等

從麥加朝圣返回的朝圣者可能導致呼吸道病原體的國際傳播。2013年，對129個朝圣者離開法國前及離開沙特阿拉伯前的鼻和咽拭子標本進行了呼吸道病毒和細菌的PCR檢測?？傮w而言，分別有21.5%和38.8%的朝圣前和朝圣后的標本，發現一個以上病毒陽性(P=0.003)。在沙特阿拉伯期間，29.8%的參與者獲得了一個以上的病毒，尤其是鼻病毒 (14.0%)，冠狀病毒 E229 (12.4%)及H3N2甲型流感病毒 (6.2%)，無一例參與者發現中東呼吸綜合征冠狀病毒陽性。此外，分別有50.0% 和 62.0%朝圣前和朝圣后的標本肺炎鏈球菌陽性 (P=0.053)。36.3%的參與者在逗留期間獲得了肺炎鏈球菌。我們的研究結果證實了在朝圣者中鼻病毒和肺炎鏈球菌的高采集率，也強調了對冠狀病毒E229的采集。

P1828 2010-2011年意大利人基因IV型諾如病毒抗體血清陽性率\ Barbara Di Martino，Federica Di Profio，Chiara Ceci，等

基因IV型(GIV) (α粒子樣)諾如病毒 (NoVs)導致人及肉食性動物，如狗和貓的感染。我們在意大利篩查了535份按年齡分層收集的人血清標本，使用在人傳播的GIV.1基因型和在動物中確定的GIV.2基因型的病毒樣顆粒，通過ELISA法來調查GIV NoV特異性IgG抗體的流行率。對兩個基因型特異抗體均進行了檢測，不同年齡組中GIV.1流行率范圍為6.6%～44.8%，GIV.2流行率范圍為6.8%～15.1%。 這些數據與人群中GIV.1菌株流行率較高相符。GIV.2抗體分析結果提示了動物源性NoVs 的人獸共患傳播，可能歸因于人與家養寵物間的相互作用。這一發現及近期記錄的人NoVs傳染狗，表明了人和動物NoVs進化關系的可能性。

P1841 美國印第安納州印第安納波利斯地區異性戀性伴侶中的新型沙眼衣原體\ Byron E. Batteiger，Raymond Wan，James A. Williams，等沙眼衣原體導致全球范圍內大量的性病傳播，但是缺乏可重復性和精確的菌株分型以建立伴侶間的關聯。為此我們通過檢測序列分型(STs)和單基因分型標準ompA基因分型的一致性來評估多位點序列分型(MLST) 。我們對2000年4月到2003年10月間收集自美國印第安納州印第安納波利斯地區，自報在過去30 d內建立了異性戀性伴侶關系

1.內蒙古民族大學生命科學學院生物化學與分子生物學教研室,通遼 028000; 2.內蒙古民族大學乳源性致病菌研究所,通遼 028000; 3.內蒙古民族大學醫學院病原生物與免疫學教研室,通遼 028000 Email:jilinbl@126.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.020

R378.1

A

1002-2694(2015)01-0092-04

2014-07-22；

2014-11-19

內蒙古自治區自然科學基金(No.2011BS0401),內蒙古民族大學博士科研啟動基金(No.BS280)