食肉動物細小病毒結構蛋白VP2的研究進展

林 鵬，王建科，趙 航，程世鵬

(中國農業科學院特產研究所吉林省特種經濟動物分子生物學重點實驗室，吉林長春 130112)

食肉動物細小病毒主要包括犬細小病毒(Canine parvovirus，CPV)、水貂腸炎病毒(Mink enteritis virus，MEV)及貓泛白細胞減少癥病毒(Feline panleukopenia virus，FPV)，屬于細小病毒科、細小病毒屬。這些病毒具有很高的親緣關系，基因組核苷酸及蛋白質序列相似性高達98 %以上，并且呈全球性流行。細小病毒引起的疾病對我國犬科、貓科及鼬科等動物危害非常嚴重，并造成較大的經濟損失。

目前，對細小病毒研究越來越深入，其中VP2 作為細小病毒主要的結構蛋白，對其結構和功能的了解更加全面：細小病毒的抗原位點主要分布于該蛋白中、該蛋白能夠刺激機體產生中和抗體、決定宿主范圍以及病毒與宿主之間相互作用，而且該蛋白與病毒的血凝特性有關[1]。本文主要從食肉動物細小病毒的生物學特性、VP2 蛋白功能、疫苗的研發情況及病原的檢測方法等角度進行歸納總結，為防制疾病的傳播和研制新型疫苗等方面提供參考。

1 食肉細小病毒的生物學特性

1.1 細小病毒的形態特點 食肉動物細小病毒隸屬于細小病毒科(Parvoviridae)，細小病毒屬(Parvovirus)，病毒粒子為等軸對稱二十面體，無囊膜，大小在18 nm～26 nm之間。

1.2 細小病毒基因組結構 食肉動物細小病毒基因組為單鏈DNA，其長度約為5 000 nt，基因組的3' 端和5' 端分別含有約為200 nt 和60 nt 反向重復序列，發夾結構與病毒DNA 的復制及其轉錄密切相關；其3' 末端的羥基為細小病毒基因組復制的引物，若磷酸化后，可以保護病毒的DNA 不被降解。由于細小病毒為無囊膜病毒，因此對外界具有較強的抵抗力，酒精、氯仿等有機溶劑具有抵抗性。病毒的基因組中含有兩個主要的開放閱讀框(ORF)，分別編碼結構蛋白(VP1、VP2 及VP3)和非結構蛋白(NS1、NS2)，它們是通過可變剪接形成不同的翻譯模板，并且有些細小病毒還存在其他小的ORF。VP1 參與病毒感染細胞和病毒衣殼蛋白組裝，其N 端為結合病毒基因組的3'端，有助于穩定病毒基因和引導病毒的基因進入細胞核中；VP3 是由VP2 在蛋白酶作用下裂解產生的，并且只存在完整的病毒粒子中。

VP2 約占病毒粒子衣殼蛋白的90 %，作為病毒的主要蛋白與病毒的致病性、宿主的范圍密切相關，并且具有良好的免疫原性，是刺激機體產生中和抗體的主要抗原表位。其中幾個重要的氨基酸發生改變，能夠導致病毒的致病性、抗原特性甚至宿主的范圍均會發生改變。

1.3 血凝特性 細小病毒具有血凝的特性，能夠引起恒河猴、豬、馬、貓和倉鼠等紅細胞凝集，這一特性可以作為鑒定該病毒的一個重要指標。血凝特性受pH 值的影響，VP2 第375 位氨基酸殘基能夠影響凝集紅細胞時pH值大小，FPV 在該位點為Asp，而CPV 則為Asn，由于該位點的差異導致FPV 的紅細胞凝集最低的pH 值為6.5，而CPV 與FPV 最高pH 值可以達到8.0；同時該位點也能調控與轉鐵蛋白受體(Transferrin receptor，TfR)結合能力和影響宿主的范圍。研究顯示CPV 和FPV 能夠識別非人類紅細胞上的唾液酸羥乙酰神經氨酸(N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc)[2]，細小病毒科中許多病毒均依賴于宿主的唾液酸進行直接吸附或者感染[3]，如鼠細小病毒(Murine minute virus，MVM)能夠直接結合Neu5Gc，而不同MVM病毒株的感染力和毒力是由與唾液酸結合能力的差異所導致的。犬和貓不同組織中均存在Neu5Gc，但缺少系統的研究。細小病毒凝集紅細胞主要反映在紅細胞上的Neu5Gc 的含量，而血凝效價與紅細胞表面Neu5Gc 含量無關。

2 VP2結構蛋白的功能

2.1 VP2蛋白的結構 細小病毒mRNA 在啟動子P38 控制下轉錄，翻譯形成VP1，通過剪接后翻譯形成VP2。CPV 衣殼蛋白主要由8 個反向平行的β-折疊桶和4 個鑲嵌于p 折疊的大環組成；VP2 由無規則卷曲形式構成，分別為Loop1、Loop2、Loop3、Loop4 和Loop5。環的結構決定病毒的性質，如中和抗體的主要抗原表位是由環的結構決定，VP2N 端及其蛋白轉角結構區是重要的B 細胞抗原表位區，這些區域氨基酸殘基的變化會導致抗原漂移。

2.2 VP2蛋白基因的遺傳進化 對CPV 和FPV 進化方式研究發現，普遍認為CPV 來自于FPV，FPV 是MEV 和CPV 的祖先[4]。在芬蘭，從狐貍體內分離到藍狐細小病毒，通過分析其vp2 基因序列發現介于FPV 和CPV-2 之間，FPV 感染水貂和狐貍等毛皮動物可能對FPV 向CPV-2 型轉變起過渡作用。FPV 和MEV 的VP2 序列之間只存在4 個氨基酸殘基的差異(第79、106、116 和335位)；FPV 與CPV 型之間也僅僅存在6 個氨基酸殘基的差異(第80、89、103、323、564 和568 位)。通過系統發育樹分析表明FPV 基因是通過隨機遺傳而改變，而CPV 是在有選擇壓力的情況下發生的。

CPV-2 型首次分離于1978 年，隨后在1980 年后分離到新的病毒株，分析該病毒株為CPV-2 的亞型，命名為CPV-2a 型；隨后又發現一個新的亞型CPV-2b 型；最近報道新的亞型為CPV-2c 型。從CPV-2 型經歷CPV-2a 型、CPV-2b 型直到CPV-2c 型只在5 個位點氨基酸殘基發生變化(第87、300、305、426 和559 位)。VP2 上少數氨基酸殘基的改變，能夠導致該蛋白空間構象改變，從而可能使病毒宿主的范圍和致病性等發生顯著地變化。CPV VP2中第87 位、第101 位和第305 位氨基酸殘基位于抗原位點A 和B 上，若其改變能夠導致蛋白構象發生改變，這與氨基酸側鏈發生變化或者氫鍵的得失有關[5]；目前在中國大陸、中國臺灣、日本、烏拉圭和韓國等地區分離的CPV-2a 型中大部分存在T324I 現象[6]。目前研究顯示CPV-2 型感染宿主的范圍在不斷地變化，CPV 各個亞型能夠引起臨床癥狀與FPV 引起的癥狀非常相似，推測CPV 可能重新適應貓科動物，所以細小病毒的宿主范圍擴大可能導致出現新的亞型；Ikeda 通過分析所分離FPV的VP2 氨基酸序列，顯示第323 位氨基酸殘基由FPV 特有的Asp 突變為CPV 的Asn，表明VP2 序列中的一個或者幾個位點可以控制宿主的范圍[7]。從發病猴子體內分離到一株FPV，序列分析顯示第323 位和第564 位氨基酸均發生突變，很有可能由于這兩個位點改變使FPV 具有感染猴子的能力[8]。

病毒進化一般通過3 種方式實現：疫苗選擇壓力、病毒在機體內發生重組和病毒在自然條件下發生變異。其中基因重組是細小病毒進化的一種重要的機制。研究顯示基因重組常常存在于機體同時感染不同種類的細小病毒[9]。在犬體內能夠同時感染CPV-2b 型與CPV-2c 型[10]、CPV-2a 型與CPV-2c 型，在貓體內也能同時感染CPV 和FPV[9]，目前已經證實在vp 基因上出現FPV 與CPV，FPV與CPV 基因重組[11-12]，并且CPV、MEV 和FPV 之間存在免疫學交叉反應。研究表明FPV 弱毒疫苗在免疫貓后能夠抵抗CPV-2b 型感染[13]；合成CPV VP2 肽段免疫水貂后能免受MEV 的感染；經福爾馬林滅活的FPV 免疫水貂后，能夠保護水貂免受感染。CPV 亞型之間也可以進行保護，如CPV-2b 亞型疫苗免疫犬后能刺激機體產生CPV-2a 亞型和CPV-2c 亞型的抗體[14]，但也存在特有的抗原表位。

通過單核苷酸多態性分析顯示，CPV vp2 基因序列中第1 276～1 278 位決定第426 位氨基酸殘基，CPV-2a 型為Asn、CPV-2b 型為Asp、CPV-2c 型為Glu。通過復雜的動力選擇表明，CPV VP2 第426 位氨基酸殘基也不斷發生改變，使得CPV 抗原性在不斷地變化，因此VP2 氨基酸序列個別位點的突變可能改變致病性[15]。CPV-2c 型比CPV 其他型感染犬的臨床癥狀和致死率都要高；如果反復接種疫苗，在病毒復制的過程中第426 位氨基酸殘基突變為Glu 的幾率就大的多[16]。目前CPV VP2 第300 位和第426 位氨基酸殘基仍存在突變，可能CPV 仍處在變異及進化的過程。CPV VP2 中存在T440A，但該突變的功能還不清楚，有待于進一步的研究[17]。CPV VP2 中第267 位到498 位之間氨基酸殘基能形成GH 環，位于βG 和βH之間，該段對細小病毒變異影響最大[17]。FPV 和CPV 在抗原性方面存在明顯的差異，可能主要由于VP2 中第93位和第323 位氨基酸殘基差異所導致的。

研究發現一只3 月齡的貓體內同時感染CPV-2a 和FPV，認為是FPV 和CPV 中間體的細小病毒變異體，該病毒同時含有CPV-2a 型和FPV 特異的表位。FPV 和CPV重組后，VP2 第80 位、564 位和568 位氨基酸殘基對該重組病毒感染宿主的范圍起到一定的重要作用。目前已經研究顯示貓能夠感染CPV 2a 型、2b 型和2c 型[18]。

2.3 轉鐵蛋白受體 細小病毒在感染的過程中，病毒表面的VP2 與宿主細胞膜表面上的TfR 相結合，通過依賴Dynamin 和Clathrin 介導的內吞現象運至內涵體，從而使病毒感染宿主細胞內。病毒被內吞后在細胞質運輸是一個緩慢的過程。CPV 結合細胞表面的TfR 后，在細胞膜下聚集，質膜內陷形成小泡，包被CPV 粒子，進入早期胞內體；小泡與膜進行分離時需要動力蛋白的參與；該動力蛋白在CPV 和受體共同定向轉移到細胞核中起重要作用。細胞質中的pH 值能夠影響病毒的感染[17]，此外病毒在感染過程中也會受到環境溫度和離子濃度等因素影響，可能導致病毒受體和病毒編碼蛋白的空間構象以及化學鍵之間的相互作用發生改變，從而導致病毒感染力下降。CPV VP2 第299 位和300 位氨基酸殘基影響與TfR 相結合，研究顯示TfR 中L221S 或者L221D 的點突變能夠抑制病毒的感染能力[19]；還有些報道TfR 部分缺失Tyr-Thr-Arg-Phe 會降低病毒進入細胞的能力。重組TfR 與CPV VP2 結合后，能夠抑制CPV 感染機體細胞，從而降低了犬的死亡率。在CPV-2 型中VP2 發生G299E 突變時，完全失去了與犬細胞上TfR 的結合，從而失去感染犬細胞的能力[20]。

目前細小病毒的宿主存在特異的TfR，例如FPV 只能結合貓源的TfR，但CPV 不僅能結合貓源的TfR 還能結合犬源的TfR。TfR 的N 端第135～430 位之間氨基酸殘基決定病毒對宿主細胞的嗜性，CPV-2 型與貓或水貂的細胞結合程度比CPV-2b 型強，主要是由于第87 位和101位的氨基酸殘基，但第305 位氨基酸作用較小[5]。

某些細小病毒感染細胞是通過受體結合蛋白識別宿主的唾液酸受體，導致病毒直接吸附宿主細胞或者提高與細胞的結合能力。當FPV 和CPV 與TfR 結合時，唾液酸起重要作用，能增加細胞表面上Neu5Gc 的含量，而在體外則不能增加[2]，該機制也是細小病毒感染細胞的一種方式[21]。TfR 在惡性腫瘤細胞中含量較高，可能該受體與細胞增殖相關。

2.4 VP2在疫苗研究上的應用 由于VP2 具有較強的免疫原性，是產生中和抗體的主要病毒抗原，所以不僅傳統疫苗(滅活疫苗、弱毒疫苗)利用此特性，而且新型疫苗(基因工程亞單位疫苗、DNA 疫苗、轉基因植物疫苗、基因工程重組活載體疫苗、表位疫苗等)的研究也集中到VP2 上。目前疫苗接種是防制食肉動物細小病毒病的一項重要手段，但由于該病毒的持續不斷地變異，可能導致出現免疫失敗現象。

2.4.1 傳統疫苗 吳威采用單克隆抗體(MAb)對我國MEV 進行系統分型，篩選出毒力穩定、免疫原性良好的病毒株，并且研制出MEV 滅活疫苗；通過CPV 在犬體內連續傳代的方式研發出弱毒疫苗，此疫苗能夠誘導機體產生抗CPV 的中和抗體；Wilson 等發現針對CPV-2b 型的疫苗免疫犬后，能夠產生中和抗體，保護機體免受不同亞型CPV 病毒株的攻擊，提供交叉保護[14]。

2.4.2 新型疫苗 食肉動物細小病毒VP2 是抗原決定蛋白，VP2 單獨表達能夠產生良好的免疫源性，可以刺激機體產生中和抗體，對動物機體無毒副作用。VP2 可以形成一個不含病毒核酸的病毒樣顆粒(Virus like particle,VLPs)，在病毒形態上與原病毒相似。當VLPs 免疫小鼠后，刺激CD4+和CD8+T 淋巴細胞，誘導機體產生體液免疫和細胞免疫。VLPs 可以作為疫苗，防制疾病的發生，具有安全性高、免疫性強等優點。

利用含有vp2 基因表達重組質粒和桿狀病毒表達系統表達VP2 免疫犬后均能夠得到良好的免疫保護；CPV vp2基因與狂犬病病毒的糖蛋白基因共同連接到pIRES 載體上，可以表達2 種抗原蛋白的雙順反子DNA 疫苗[22]；將MEV vp2 基因構建轉基因植物疫苗，能夠對MEV 的強毒感染具有良好的免疫保護作用[23]；CPV VP2 抗原表位2L21 連接到霍亂毒素基因上并且在煙草的葉綠體中融合表達的重組蛋白，免疫小鼠能夠產生高效價的抗2L21 的抗體，可以在體外中和CPV[24]；利用犬2 型腺病毒構建FPV VP2 重組腺病毒活載體疫苗，免疫后能夠誘導機體產生抗體[25]。未來隨著DNA 疫苗的發展，有可能也會應用到水貂病毒性腸炎的預防上；Zhang 等利用噬菌體展示技術篩選出與MEV 結合強的多肽，為研制高效、特異性強的疫苗奠定了基礎[26]。

2.5 VP2在診斷方面的應用 目前細小病毒病的診斷方法有形態學鑒定診斷、血清學診斷、分子生物學診斷以及動物回歸實驗等。其中血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗、ELISA、中和試驗和PCR 等多種實驗技術都是利用VP2及其編碼基因的特性進行細小病毒病的診斷。

以細小病毒vp2 基因為模板，建立的SYBR Green 染料法的實時定量PCR，能夠同時檢測CPV、FPV 和豬細小病毒，該方法具有良好的敏感性和特異性，最低檢測量為10 拷貝/μL[27]；根據CPV vp2 基因采用隔熱式恒溫PCR 技術檢測CPV，也具有很高的敏感性和特異性，分別為98.41 %和100 %，與實時定量熒光PCR 檢測結果相當[28]；針對CPV vp2 基因采用環介導等溫擴增技術(Loopmediated isothermal amplification，LAMP)分別與ELISA 和橫向流動試紙條技術(Lateral flow dipstick，LFD)相結合檢測CPV，具有更高的敏感性和特異性，與傳統的PCR 和PCR-ELISA 相比最低檢測量提高了100 倍[29]。Horiuchi 等在制備的MAb 具有交叉反應，并能夠識別VP2 中第93位的Lys，該位點是FPV 和MEV 所特有的，可以用來鑒別FPV 和MEV 與其他病毒[4]；利用高分辨率熔解曲線(High-resolution melting，HRM)技術根據CPV-2 型vp2 基因進行快速診斷，PCR-HRM 能夠通過不同的溶解溫度的差異區分CPV-2a 型、CPV-2b 型和CPV-2c 型；該技術具有極高的敏感性、成本低廉，速度快等優點，可以實現真正意義上的閉管操作[30]。近年來膠體金免疫層析技術在獸醫臨床廣泛應用，其技術操作簡便快捷、成本低廉和直接顯示結果等優點，使其在診斷領域等方面迅速的推廣，但在食肉動物細小病毒診斷方面研究較少。

3 結語

食肉動物細小病毒在遺傳進化過程中發生基因組的突變和重組等，病毒變異株不斷產生，從而導致病毒的宿主范圍可能不斷地擴大，改變致病性等特性。分析顯示細小病毒變異株具有各自的抗原特性，這就對疫苗的保護效力提出更高的要求。目前細小病毒在野生動物之間、野生動物與飼養食肉動物之間的傳播尚未清楚，這為我們提供下一步的研究方向。

預防食肉動物細小病毒病的手段主要是接種疫苗，目前也出現一些問題，例如長期接種弱毒疫苗引起病毒血癥、免疫失敗引起疾病的發生等問題[18]。隨著科技水平不斷的提高，對食肉動物細小病毒進行了深入的研究，尤其對VP2 結構蛋白的認識不斷的加深，將更好的了解細小病毒如何感染宿主細胞的工作機制，為細小病毒病的綜合防制提供了堅實的理論基礎，從而保證相關的養殖業更好地發展。

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