大豆過敏原免疫學檢測方法研究進展

王 耀 鄧瑞廣 張改平，3 王方雨 李志西 胡驍飛

（農業部動物免疫學重點實驗室，河南省動物免疫學重點實驗室，河南省農業科學院1，鄭州 450002）（西北農林科技大學食品科學與工程學院2，楊凌 712100）（河南農業大學牧醫工程學院學院3，鄭州 450002）

大豆過敏原免疫學檢測方法研究進展

王 耀1，2鄧瑞廣1張改平1，3王方雨1李志西2胡驍飛1

（農業部動物免疫學重點實驗室，河南省動物免疫學重點實驗室，河南省農業科學院1，鄭州 450002）（西北農林科技大學食品科學與工程學院2，楊凌 712100）（河南農業大學牧醫工程學院學院3，鄭州 450002）

作為一種重要的糧食作物，大豆應用廣泛并在人類和動物營養方面起著至關重要的作用，但大豆中也含有多種過敏原，能夠誘發超敏反應，導致機體損傷。隨著人們對食品過敏問題的日益重視，各種針對大豆過敏原的快速、準確的檢測方法得到了發展，其中免疫學方法具有靈敏性高、特異性強的特點，能夠對過敏原進行定性、定量檢測而成為研究熱點。本文綜述了針對大豆過敏原的免疫學檢測方法，并對今后的研究方向進行了初步探討。

大豆 過敏原 免疫學檢測

大豆中蛋白質含量豐富，一般為35%～38%，氨基酸組成平衡，且富含不飽和脂肪酸，是人體和動物體重要的植物蛋白和植物油來源。由于其種植面積廣，產量大，長久以來一直被廣泛應用于食品和飼料的加工原料。然而，大豆也是聯合國糧農組織認定的8種最重要的食物過敏源之一［1］。主要是因為大豆中含有一系列過敏原，容易在嬰幼兒和幼齡動物體內引起IgE（Immunoglobulin E）抗體介導的速發型（Ⅰ型）超敏反應，從而導致腸內組胺過量釋放等過敏性損傷。近幾年，食物過敏逐漸成為重要的食品安全問題，引起了各國食品安全監督管理部門的重視。一些發達國家為保護食物過敏人群，專門立法規定食品包裝上要標注食物過敏原，我國在2012年實施的食品安全國家標準《預包裝食品標簽通則》（GB 7718—2011）中也推薦食品包裝上標注致敏物質。因此，針對食品過敏原的檢測技術就顯得意義重大，可為食品安全提供重要的技術依據。

免疫學檢測方法具有靈敏性高、特異性強的特點，能夠快速、準確對抗原物質進行定性定量檢測，并且不需要復雜的程序和價格高昂的儀器，目前已在過敏原檢測中得到了廣泛應用［2－3］。本文對大豆過敏原的免疫學檢測方法進行了論述，對今后的研究方向進行了初步探討。

1 大豆過敏原

自1934年Duke［4］發現大豆可引起嬰兒腹瀉、腸炎等反應，提出大豆可能是一個重要的過敏源以來，人們對于大豆中致敏因子的研究逐步深入。過敏原數據庫網站（http：//www.allergenonline.org）在 2014年1月更新的數據信息顯示，大豆中共存在38種過敏原，這些過敏原是大豆及其制品中能夠導致人或畜禽過敏的蛋白質或糖蛋白，包括大豆疏水蛋白（Glym 1）、大豆外殼蛋白（Gly m 2）、大豆抑制蛋白（Glym 3）、大豆球蛋白（Glycinin）、β－伴大豆球蛋白（β－conglycinin）、大豆空泡蛋白（Glym Bd 30K）、胰蛋白酶抑制劑（KTI）等［5］。其中 glycinin與 βconglycinin占大豆籽實總蛋白的70%～80%，是大豆中最主要的兩種致敏蛋白［6］，也是致敏性最強的蛋白［7－8］。

2 免疫學檢測方法

據統計，大豆過敏原會導致大約0.4%的兒童產生過敏反應［9］，并且大量的動物試驗研究也表明，glycinin和 β－conglycinin可以導致犢牛［10］、仔豬［11－12］和鼠［13］等幼齡動物發生過敏反應。一些大豆過敏原具有很高的穩定性［14］，當其存在于嬰幼兒食品以及幼齡動物飼料中，就很可能會誘發過敏反應。但是，嬰幼兒配方食品和復合飼料所用的原料成分較多，其中存在的大豆過敏原含量相對于其他原料往往很低，這就增加了快速、準確、定量檢測的難度。

免疫學檢測方法是基于蛋白的檢測方法，在獲得抗大豆過敏原的抗體的基礎上，利用抗原－抗體反應建立起來的一種針對抗原蛋白的檢測方法。包括免疫印跡（Immunoblotting）、放射過敏原吸附試驗（Radio－allergosorbent test，RAST）、酶聯過敏原吸附試驗（Enzyme allergosorbent test，EAST）、酶聯免疫吸附 試 驗 （Enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）等。

2.1 免疫印跡

免疫印跡在過敏原的檢測中應用較早，并且廣泛應用于發現和鑒定新的過敏原［15］。該法又稱為蛋白質印跡（Western blotting），是將聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）和固相免疫測定技術相結合。其原理是首先將樣品進行單向或雙向凝膠電泳，抗原蛋白根據其分子量大小分離，然后將分離的蛋白在電場力的作用下轉移到固定化基質膜上，最后利用放射物質或者酶標記的抗體對膜進行檢測和分析。Janssen等［16］利用此方法檢測了肉制品中大豆過敏原，結果為肉制品中存在大豆過敏原提供了有力證據。Gagnon等［17］將免疫印跡和質譜技術相結合，用大豆過敏患者的血清檢測出了19種大豆過敏原，包括5種新過敏原。雖然免疫印跡具有SDS－PAGE的高分辨力和固相免疫測定的特異性和敏感性，但目前該方法僅可用于過敏原的定性或半定量檢測。

2.2 放射/酶聯過敏原吸附抑制試驗（RAST/EAST Inhibition）

RAST和EAST通常用于食物過敏的臨床診斷，而RAST/EAST抑制試驗已被應用于過敏原的定性檢測以及食物中潛在過敏原的評估［18－19］。該方法的原理是首先將能與人體特異的IgE抗體結合的過敏原在固定在固相載體上，然后加入被測樣品，樣品溶液中的過敏原會抑制固相載體上的過敏原與IgE結合，最后加入用放射性物質或酶標記的抗IgE抗體，再加入發光或顯色的底物，用射線計數器或分光光度計來檢測結合的IgE，從而間接的檢測樣品中的過敏原。Herian等［20］利用RAST抑制試驗定性檢測了多種大豆制品（豆芽、豆豉、豆腐、豆醬、醬油等）的過敏原性，結果表明這些大豆制品都會對大豆過敏人群造成潛在的危害。Paschke等［21］利用EAST抑制試驗檢測了精煉大豆油、非精煉大豆油和大豆卵磷脂的過敏原性，結果顯示可能是由于精煉過程中的熱處理，消除了精煉大豆油的過敏原性。由于RAST/EAST抑制試驗依賴于合適的過敏人群血清并且很難建立標準的檢測方法，所以該方法在大豆過敏原定量檢測中的應用就受到了局限［22］。

2.3 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

目前，ELISA方法是實驗室、食品企業以及食品監管機構檢測食品中過敏原最常用的方法［3］。該方法主要是基于抗原或抗體的固相化以及抗原或抗體的酶標記，固相化的抗原或抗體可以保持其免疫學活性，酶標記物在保持其免疫學活性的基礎上也保留了酶的活性。常用于食品中過敏原定量檢測的ELISA方法主要有競爭ELISA（Competitive ELISA）和夾心 ELISA（Sandwich ELISA）兩種。競爭ELISA是將過敏原固定在微孔板上，與樣品中的過敏原競爭結合特異抗體；而夾心ELISA是先將過敏原的一種特異抗體固定在微孔板上，與樣品中的過敏原結合后，然后加入另一種酶標記的特異抗體與過敏原結合。這兩種方法均具有實用性強、特異性高、敏感性強等優點。

Ma等［23］在獲得glycinin單克隆抗體的基礎上建立了檢測glycinin的競爭ELISA方法，該方法的半數抑制濃度（IC50）為 1.7 ng/mL，檢測限為 0.3 ng/mL。You等［24］成功制備了β－conglycinin單克隆抗體，并建立了檢測β－conglycinin的競爭ELISA方法，該方法的 IC50為 4.7 ng/mL，檢測限為 2.0 ng/mL；Liu等［25］也建立了β－conglycinin的競爭ELISA方法，但該方法針對的是β－conglycinin上的α亞基，IC50為4.42 ng/mL，線性范圍為 0.65～29.84 ng/mL，比前者更加靈敏。Hei等［26］用鼠源 β－conglycinin單克隆抗體作為包被抗體，用兔源β－conglycinin多克隆抗體作為二抗建立了檢測β－conglycinin的夾心ELISA方法，該方法的檢測限為1.63 ng/mL，線性范圍為3～100 ng/mL。

另外，在大豆過敏原ELISA檢測方法的基礎上，出現了一些商品化的ELISA檢測試劑盒。例如Elisa Systems kit和 Veratox兩種試劑盒都是依據夾心ELISA方法研制的，前者用于檢測食品中的KTI，檢測限可以達到1 mg/kg，后者用于對曲奇、餅干、巧克力棒和谷類食品中的大豆粉進行定量，檢測范圍為2.5～25 mg/kg［27］。雖然 ELISA方法有諸多優點，但有時因為食品基質干擾，也會對檢測結果造成影響。

3 結語

綜上所述，ELISA檢測方法比其他幾種方法更具優勢，能夠快速、靈敏、特異的定量檢測過敏原，但這種方法仍需要繼續完善。一方面由于大豆過敏原種類較多，檢測過程中可能會發生交叉反應；另一方面，現有的ELISA檢測方法可能會存在基質干擾，影響檢測結果。因此需要針對單一過敏原制備出敏感性高、特異性強的抗體，并且需要制定簡單便捷的樣品處理方法，減小基質干擾，增加檢測的靈敏度和準確性。未來大豆過敏原的檢測將向經濟、快速、準確、高通量、高靈敏的方向發展。免疫層析試紙檢測方法具有成本低、快速、便攜且易操作等優點，可以用于大批量樣品的檢測，在準確性和靈敏度上也能夠滿足要求，但目前仍沒有關于大豆過敏原免疫層析試紙檢測方法的報道，所以該方法將會成為未來大豆過敏原檢測方法的一個發展方向。

［1］Hefle SL，Nordlee JA，Taylor SL.Allergenic foods［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1996，36（S1）：69－89

［2］Brett G，Bull V，Morgan M.Identification of hidden allergenswithin foods［J］.Allergy，1998，53（46）：109－110

［3］Poms RE，Klein CL，Anklam E.Methods for allergen analysis in food：a review［J］.Food Additives and Contaminants，2004，21（1）：1－31

［4］Duke W.Soy bean as a possible important source of allergy［J］.Journal of Allergy，1934，5（3）：300－302

［5］Cordle CT.Soy protein allergy：incidence and relative severity［J］.Journalof Nutrition，2004，134（5）：1213S－1219S

［6］Wang T，Qin GX，Sun ZW，et al.Advances of Research on Glycinin andβ－conglycinin：a Review of two Major Soybean Allergenic Proteins［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2014，54（7）：850－862

［7］ShibasakiM，SuzukiS，Tajima S，etal.Allergenicity ofmajor component proteins of soybean［J］.International Archives of Allergy and Immunology，1980，61（4）：441－448

［8］Krishnan HB，Kim WS，Jang S，et al.All three subunits of soybeanβ－conglycinin are potential food allergens［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（3）：938－943

［9］Savage JH，Kaeding AJ，Matsui EC，et al.The natural history of soy allergy［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology，2010，125（3）：683－686

［10］Pedersen H，Sissons J.Effect of antigenic soyabean protein on the physiology and morphology of the gut in the preruminant calf［J］.Canadian Journal of Animal Science，1984，64（5）：183－184

［11］Stokes C，Miller B，Bailey M，et al.The immune response to dietary antigens and its influence on disease susceptibility in farm animals［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，1987，17（1）：413－423

［12］Li D，Nelssen J，Reddy P，et al.Transient hypersensitivity to soybean meal in the early－weaned pig［J］.Journal of Animal Science，1990，68（6）：1790－1799

［13］Mowat AM.The regulation of immune responses to dietary protein antigens［J］.Immunology Today， 1987， 8（3）：93－98

［14］Maruyama N，Katsube T，Wada Y，et al.The roles of the N－linked glycans and extension regions of soybeanβconglycinin in folding，assembly and structural features［J］.European Journal of Biochemistry，1998，258（2）：854－862

［15］Pastorello EA，Trambaioli C.Isolation of food allergens［J］.Journal of Chromatography B：Biomedical Sciences and Applications，2001，756（1）：71－84

［16］Janssen FW，Voortman G，de Baaij JA.Detection of soya proteins in heated meat products by“blotting”and“dot blot”［J］.Zeitschrift für Lebensmittel－Untersuchung und Forschung，1986，182（6）：479－483

［17］Gagnon C，Poysa V，Cober ER，et al.Soybean allergens affecting North American patients identified by 2D gels and mass spectrometry［J］.Food Analytical Methods，2010，3（4）：363－374

［18］Nordlee JA，Taylor SL，Jones R，etal.Allergenicity of various peanut products as determined by RAST inhibition［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology，1981，68（5）：376－382

［19］Oldaeus G，Bj?rkstén B，Einarsson R，et al.Antigenicity and allergenicity of cowmilk hydrolysates intended for infant feeding［J］.Pediatric Allergy and Immunology，1991，2（4）：156－164

［20］Herian AM，Taylor SL，Bush RK.Allergenic reactivity of various soybean products as determined by RAST inhibition［J］.Journal of Food Science，1993，58（2）：385－388

［21］Paschke A，Zunker K，WigotzkiM，etal.Determination of the IgE－binding activity of soy lecithin and refined and non－refined soybean oils［J］.Journal of Chromatography B：Biomedical Sciences and Applications， 2001， 756（1）：249－254

［22］Nordlee JA，Taylor SL.Immunological analysis of food allergens and other food proteins［J］.Food Technology，1995，2：129－132

［23］Ma X，Sun P，He P，etal.Developmentofmonoclonal antibodies and a competitive ELISA detectionmethod for glycinin，an allergen in soybean［J］.Food Chemistry，2010，121（2）：546－551

［24］You JM，Li DF，Qiao SY，et al.Development of a monoclonal antibody－based competitive ELISA for detection ofβ－conglycinin，an allergen from soybean［J］.Food Chemistry，2008，106（1）：352－360

［25］Liu B，Teng D，Yang Y，et al.Development of a competitive ELISA for the detection of soybeanαsubunit ofβconglycinin ［J］.Process Biochemistry， 2012， 47（2）：280－287

［26］HeiWJ，Li Z，Ma X，etal.Determination ofbeta－conglycinin in soybean and soybean products using a sandwich enzyme－linked immunosorbent assay［J］.Analytica Chimica Acta，2012，734：62－68

［27］L′Hocine L，Boye JI.Allergenicity of soybean：new developments in identification of allergenic proteins，cross－reactivities and hypoallergenization technologies［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2007， 47（2）：127－143.

Advance in the Immunological Detection of Soybean Allergens

Wang Yao1，2Deng Ruiguang1Zhang Gaiping1，3Wang Fangyu1Li Zhixi2Hu Xiaofei1
（Key Laboratory for Animal Immunology of the Ministry of Agriculture，Henan Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences1，Zhengzhou 450002）（College of Food Science and Engineering，Northwest A＆F University2，Yangling 712100）（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University3，Zhengzhou 450002）

As an important crop，soybean iswidely used and plays a vital role in human and animal nutrition.However，soybean contains several allergens which can induce hypersensitive responses and thus lead to injury of body.Along with the increasing emphasis on food allergy problem，various kinds of rapid and accurate detection methods for soybean allergens have been developed.Among them，immunologicalmethod shall be proved to be the hotpot of current research since its advantages such as high sensitivity，strong specificity，and the ability to conduct the qualitative and quantitative detection.The paper has introduced the immunological detection method for soybean allergens and preliminary discussed the future research direction.

soybean，allergens，immunological detection

TQ432.2

A

1003－0174（2015）08－0143－04

河南省基礎與前沿技術研究計劃項目（1323004132 22），國家科技支撐計劃（2014BAD13B05）

2014－03－08

王耀，男，1986年出生，博士，食品安全檢測

胡驍飛，男，1972年出生，副研究員，畜牧獸醫及食品安全檢測