高效液相色譜法測定安徽產木通藥材中3種有效成分含量

歐金梅，儲曉琴，2，張 虹

（1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.現代中藥安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012）

木通始載于《神農本草經》，具有利尿通淋、清心除煩、通經下乳的功效[1]?！吨腥A人民共和國藥典》規定，木通的來源為木通科木通Akebia quinata（Thunb.）Decne.、三 葉 木 通Akebia trifoliate（Thunb.）Koidz.和 白 木 通Akebia trifoliate（Thunb.）Koidz.var.australis（Diels）Rehd.的藤莖[2]，有效成分為木通苯乙醇苷B、齊墩果酸、常春藤皂苷元等[3]。木通產于長江流域各省區，在日本和朝鮮有分布，長期依賴野生資源，量少不能滿足市場需要，因此藥材市場及醫院多以川木通代替木通使用。在第四次全國中藥資源調查中發現，木通、三葉木通在安徽有分布，木通主要分布在明光、滁州、巢湖、青陽、寧國等江淮丘陵及皖南山區，資源豐富；三葉木通主要分布在寧國、黃山、歙縣等皖南山區。如能進一步開發利用，可解決市場上木通藥材緊缺的問題。

本實驗以安徽產木通為對象，通過查閱相關文獻[4－10]，采用高效液相色譜法測定木通中木通苯乙醇苷B、齊墩果酸、常春藤皂苷元的含量，并與市售湖北產木通及川木通進行比較，以期為安徽產木通的質量研究提供參考依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AG285電子天平：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；LC-20AB高效液相色譜儀（包括SPD-M20A紫外檢測器、LC-20AB高壓輸液泵、LC-solution色譜工作站）：日本島津；HH-S2系列恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市環宇科學儀器廠；雙層鐵皮電爐：上海日用電爐廠；KQ-100DB數控超聲儀：江蘇省昆山超聲儀器有限公司；SF-130C萬能粉碎機：湖南省吉首市中湘制藥機械廠。

1.2 試劑 齊墩果酸（批號110709，純度≥98%）：中國食品藥品檢定研究院；常春藤皂苷元（批號111733，純度≥98.3%）：中國食品藥品檢定研究院；木通苯乙醇苷B（批號FY19730401，純度≥98%）：江蘇省南通飛宇生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純；水為純凈水；其余試劑均為分析純。木通藥材采集或購買，產地為安徽、湖北、四川，經安徽中醫藥大學周建理教授鑒定為木通科木通、三葉木通。

2 方法與結果

2.1 木通苯乙醇苷B含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱定木通苯乙醇苷B標準品2.0 mg于50 m L容量瓶中，70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得0.04 mg／m L的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取藥材粉末（過4號篩）約0.5 g，精密稱定，置于50 m L的平底燒瓶中，加70%甲醇25 m L，回流45 min后放至室溫，再稱定質量，用70%甲醇補足減失質量，搖勻，過濾。精密移取續濾液4 m L至100 m L容量瓶中，70%甲醇定容，過濾，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Alltima C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：甲醇－水－磷酸（35∶65∶0.05）；流速：1.0 m L／min；柱溫：35℃；進樣量：20μL；檢測波長：330 nm。對照品和木通藥材的高效液相色譜圖見圖1。

2.1.4 線性關系考察 按上述色譜條件，將對照品稀釋成0.004 4、0.008 8、0.013 2、0.022 0、0.030 8、0.035 2 mg／m L等一系列濃度，依次進樣。結果表明木通苯乙醇B在0.004 4～0.035 2 mg／m L濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為y＝2.734 4x＋59 146，r＝0.999 3。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，在上述色譜條件下，連續進樣6次，記錄峰面積，其RSD為0.95%。

2.1.6 穩定性試驗 稱取三葉木通（安徽歙縣）粉末，約0.5 g，按“2.1.2”項下方法制成供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h進樣分析，其峰面積 RSD為1.39%，表明供試品溶液在10 h內穩定。

2.1.7 重復性試驗 稱取三葉木通（安徽歙縣）粉末，約0.5 g，共6份，按“2.1.2”項下方法制成供試品，在上述色譜條件下測定，木通苯乙醇苷B峰面積RSD為1.43%。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱定已知含量的三葉木通粉末6份，每份0.2 g，按“2.1.2”項下方法制成供試品，分別加入一定量的木通苯乙醇苷B對照品，測定并計算加樣回收率，結果木通苯乙醇苷B的平均回收率為97.05%，RSD為1.20%。

2.1.9 樣品測定 取不同產地的木通粉末各0.5 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法操作，在上述色譜條件下測定，計算不同來源的木通藥材中木通苯乙醇苷B的含量，測定結果見表1。

2.2 齊墩果酸和常春藤皂苷元含量測定[11－12]

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱定齊墩果酸和常春藤皂苷元對照品各2.0 mg，置2 m L容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得含齊墩果酸1.15 mg／m L、常春藤皂苷元1.1 mg／m L的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 將木通藥材（過4號篩）2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 m L，超聲提取30 min，過濾，并用適量甲醇洗滌殘渣，合并濾液與洗液，水浴蒸干，殘渣加10 m L水溶解，用水飽和正丁醇萃取3次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇20 m L、40%鹽酸2 m L，加熱回流4 h，水解產物加水10 m L，用三氯甲烷萃取3次，合并濾液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，并定容至10 m L容量瓶中，搖勻即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Alltima C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：乙腈－水（65∶35）；流速：1.0 m L／min；柱溫：25℃；進樣量：20μL；檢測波長：203 nm。對照品和木通藥材的高效液相色譜圖見圖2。

2.2.4 線性關系考察 按上述色譜條件，齊墩果酸標準品制成0.145、0.233、0.330、0.460、0.580、0.600 mg／m L，常春藤皂苷元標準品制成 0.21、0.33、0.42、0.60、0.70、0.84 mg／m L 等一系列濃度，依次進樣。結果表明，齊墩果酸在0.145～0.60 mg／m L范圍內與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為y＝5 992.4x＋5.0×105，r＝0.999 0。常春藤皂苷元在0.008 4～0.033 6 mg／mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為y＝7 108.8x＋8.8×105，r＝0.999 5。

2.2.5 精密度試驗 取1.15 mg／mL齊墩果酸，1.1 mg／mL常春藤皂苷元對照品溶液，按上述色譜條件，進樣40μL，連續進樣6次，記錄峰面積。齊墩果酸和常春藤皂苷元峰面積的RSD分別為1.93%、1.34%。

2.2.6 穩定性試驗 稱取木通（安徽青陽）粉末，約2 g，按“2.2.2”項下方法制成供試品，分別于0、2、4、6、8、10 h進樣分析，分別測得齊墩果酸和常春藤皂苷元峰面積的RSD為1.97%、1.67%，表明供試品溶液在10 h內穩定。

2.2.7 重復性試驗 稱取木通（安徽青陽）藥材粉末，約2 g，共6份，按“2.2.2”項下方法制成供試品，在上述色譜條件下測定，齊墩果酸和常春藤皂苷元的 RSD分別是1.19%、1.33%。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱定取已知含量的木通粉末，約2 g，共6份，按“2.2.2”項下方法制成供試品，精確加入一定量的齊墩果酸對照品和常春藤皂苷元對照品，測定并計算加樣回收率，結果齊墩果酸平均回收率為95.43%（RSD＝2.00%），常春藤皂苷元平均回收率為95.04%（RSD＝2.06%）。

2.2.9 樣品測定 取不同產地的木通各2 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法操作，在上述色譜條件下測定，計算不同來源的木通藥材中齊墩果酸和常春藤皂苷元的含量，測定結果見表1。

表1 不同產地木通中木通苯乙醇苷B、齊墩果酸和常春藤皂苷元的含量

3 討論

3.1 流動相的選擇 本實驗中選擇乙腈－水（65∶35）為齊墩果酸和常春藤皂苷元的流動相，其中乙腈能夠很好地將兩個成分洗脫并使兩個成分得到良好的分離。

3.2 檢測波長的選擇 通過全波長掃描，結果齊墩果酸和常春藤皂苷元在205 nm處有最大吸收，但干擾較大，經試驗選擇203 nm為測定波長。而木通苯乙醇苷B在330 nm處有最大吸收，且干擾少。

3.3 多種有效成分含量測定 《中華人民共和國藥典》規定木通的指標性成分為木通苯乙醇苷B，但單一成分往往不能全面評價一味中藥的藥效，因此，筆者結合文獻增加了木通中齊墩果酸和常春藤皂苷元的含量測定，能更全面地評價木通藥材的質量。

含量測定結果表明，安徽寧國及明光產木通中有效成分木通苯乙醇苷B、齊墩果酸和常春藤皂苷元成分含量高于市售木通，如能進行深入研究，擴大木通藥材的產地及產量，滿足市場需求，可解決市場上因正品木通來源不足而導致混用品繁雜的問題。

[1]中華本草編委會.中華本草：第3冊[M].上海：上?？茖W技術出版社，1999：330-335.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：59.

[3]高慧敏，王智民，曲莉，等.RP-HPLC測定木通中木通苯乙醇苷B的含量[J].中國中藥雜志，2007，32（6）：476-478.

[4]高慧敏，王智民，曲莉，等.RP-HPLC測定木通中木通苯乙醇苷B的含量[J].中國中藥雜志，2007，32（6）：476-478.

[5]馬雙成，劉燕，畢培曦，等.RP-HPLC法測定金銀花藥材中常春藤皂苷元及齊墩果酸的含量[J].藥物分析雜志，2006，26（7）：885-887.

[6]劉巖庭，侯雄軍，謝月，等.木通屬植物化學成分及藥理作用研究進展[J].江西中醫學院學報，2012，24（4）：87-93.

[7]成曉霞，孫榮榮，歐陽浩楠，等.三葉木通中常春藤皂苷[J].安徽農業科學，2008，36（16）：6792-6794.

[8]袁賢達，高慧敏，王智民，等.基于木通皂苷探討中藥質量評價用對照提取物研究[J].中國中藥雜志，2012，37（16）：2413-2416.

[9]劉桂艷，馬雙成，鄭健，等.木通中共有成分木通酸和木通皂苷Stc的檢測[J].分析化學，2008，36（5）：683-686.

[10]張錚，王喆之.三葉木通不同部位有效成分含量比較研究[J].中藥材，2005，28（11）：983-984.

[11]劉一兵，羅晉萍，張靜靜.蒸發光散射－高效液相色譜法測定三葉木通中齊墩果酸的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16（3）：38-39.

[12]楊勝丹，余林春，付大友.半制備高效液相色譜法分離純化川木通中齊墩果酸[J].應用化工，2011，40（1）：173-175.