三七總皂苷對大鼠大腦缺血再灌注VEGF表達的影響

蔣會慧

(安徽醫科大學藥理學教研室　亳州職業技術學院藥學院，安徽 亳州 236800)

王園園

(亳州職業技術學院藥學院，安徽 亳州 236800)

胡東華

(安徽醫科大學藥理學教研室，安徽 合肥 230032)

江榮炎

(亳州市人民醫院心血管內科，安徽 亳州 236800)

三七總皂苷對大鼠大腦缺血再灌注VEGF表達的影響

蔣會慧

(安徽醫科大學藥理學教研室亳州職業技術學院藥學院，安徽 亳州 236800)

王園園

(亳州職業技術學院藥學院，安徽 亳州 236800)

胡東華

(安徽醫科大學藥理學教研室，安徽 合肥 230032)

江榮炎

(亳州市人民醫院心血管內科，安徽 亳州 236800)

[摘要]目的:觀察三七總皂苷(PNS)對預處理大鼠大腦缺血再灌注后血管內皮細胞生長因子( VEGF)表達的影響。方法:將48只SD大鼠隨機平均分為假手術組、模型組、PNS組和尼莫地平對照組。預給大鼠PNS 7d后，制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。觀察各組大鼠神經功能評分及大腦TTC染色，從VEGF的角度檢測免疫組化和mRNA水平表達情況。結果: PNS可以顯著改善大鼠神經功能評分和降低腦梗死體積，并可增加VEGF蛋白表達和上調VEGF mRNA表達水平。結論:PNS能有效上調腦缺血再灌注損傷后VEGF mRNA濃度的表達，促進缺血區血管新生。

[關鍵詞]三七總皂苷(PNS); 腦缺血; 再灌注損傷；血管內皮細胞生長因子( VEGF)

缺血性腦血管病(Ischemic Cerebral Vascular Disease，ICVD)是一種嚴重威脅人類健康的心腦血管疾病，占腦血管病的60%～80%。隨著當今社會的老齡化，其發病率在不斷增高，如何有效的降低死亡率和致殘率是治療該類疾病的核心問題。三七總皂苷(Panax notoginseng saponin, PNS) 是五加科植物三七的主要活性成分，也是臨床治療心腦血管病藥物血栓通注射液的主要成份。PNS中三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Rg1、Rd和Re約占總皂苷含量的80%[1]，具有防止脂質沉積、抑制血管平滑肌細胞增殖、促纖溶及抑制血小板聚集、促進微循環、抗動脈粥樣硬化和保護心肌等作用[2,3]。血管內皮細胞生長因子( VEGF) 又稱血管通透性因子( VPF) ，可特異性地作用于血管內皮細胞， 促進血管內皮細胞的新生，并增加其通透性。本實驗以腦缺血再灌注損傷中VEGF mRNA表達水平為切入點，在大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion ,MCAO)再灌注模型上觀察PNS對VEGF表達的影響，旨在探討PNS在缺血性腦血管病治療與恢復中的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物

SD雄性大鼠，SPF級，質量180～220g，安徽醫科大學實驗動物中心提供(動物合格證號：SCXK( 皖) 2005-001)。動物常規喂養，自由飲水；飼養室光10h，黑暗14h，溫度21～25 ℃，濕度30%～70%。

1.2藥物和主要試劑

PNS，麗珠集團利民制藥廠(批號：ZZ-5802， 粵衛藥準字( 1994) 第801313號)，使用時用生理鹽水配成質量濃度為2.5g/L。陽性對照藥尼莫地平注射液(浙江一新制藥股份有限公司，批號：01092001，規格20mg/100mL )，使用時用生理鹽水配成質量濃度為0.1mg/mL[4]。紅四氮唑( 2, 3, 5-Triph-enyltetrazoliumchloride，TTC，中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司，批號20010201) ；RNApure 超純總RNA快速提取試劑盒(博邁德生物)；VEGF抗大鼠一抗購自Santa Crutz公司；Trans Script TM One-Step RT-PCR Super Mix(北京全式金生物技術有限公司)；兔SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉生物制劑公司；Fast SYBR@Green Master Mix (Applied Biosystems)；其他試劑均為市售分析純。

1.3分組與給藥

雄性大鼠48只按體重隨機分為4組，即假手術組、模型組、PNS組和尼莫地平對照組(每組12只)。各組大鼠預給藥7d，1次/d，PNS給藥劑量為2.5g/L，尼莫地平注射液給藥劑量為0.1mg/mL，均為臨床等效劑量[4]；以同等體積的生理鹽水給予假手術組和模型組。

1.4模型建立及標本采集

參照Longa等[5]的線栓改良法制備大鼠左側大腦MCAO局灶性腦缺血模型。采用10% 水合氯醛 ( 350mg/kg，ip) 麻醉大鼠，制備腦缺血再灌注模型；缺血2h后再灌注24h，仰臥位固定大鼠，將線栓輕輕外抽，實現再灌注，剪斷線栓。剔除死亡及不符合標準的動物，蘇醒后行走向左旋轉或左側肢體癱瘓的大鼠為栓堵或者再灌注成功。假手術組僅分離血管。大鼠于造模成功后，斷頭處死，取腦組織，按檢測指標要求的不同貯存于甲醛或液氮中。

1.5觀察指標

1)神經行為評分(NBS)。采用Longa評分法[5]。 0分：無神經功能缺失癥狀；1分：輕度局造性神經功能缺失(不能完全伸展左側前肢)；2分：中度神經功能缺失(向左側轉圈)；3分：重度神經功能缺失(向左側傾倒)；4分：不能自發行走，意識水平降低。

2)TTC染色，觀察腦梗死體積。腦缺血再灌注24h后，將大鼠斷頭取大腦，將完整的大腦置于盛生理鹽水的培養皿，沿冠面均勻切成厚約2mm的五片腦組織，迅速移至用生理鹽水配制的2% TTC液體，避光染色，37℃孵育0.5h。搖動培養皿以充分反應，腦片中正常組織被染成紅色，梗死組織呈白色，30min后將腦組織從孵育的培養皿中拿出，置于4%多聚甲醛溶液中，換液兩次，4℃冰箱固定24h，用相機拍下記錄[6]。

3)免疫組化測定。每組取3只做免疫組化鑒定，用免疫組化染色(ABC法)[7]，組織薄片以PBS(0.01mol/L)漂洗2次, 0.3%過氧化氫孵育10min; PBS漂洗3次, 正常山羊血清37℃孵育15min后, 滴加稀釋后的一抗(VEGF為：1∶200)稀釋倍數。陰性對照以0.01mol/LPBS代替1抗。光學顯微鏡觀察免疫組化染色結果，組織片中細胞質呈棕黃色者為免疫反應陽性細胞。

4)Real Time PCR測定VEGF mRNA水平。每組實驗結束后，取3只大鼠斷頭取大腦，液氮速凍后-80℃冰箱保存備用。取出腦組織適量，提取總RNA，電泳分析表明A260/A280比值在1.7～2.0之間，總RNA片段完整未降解，可以用于下一步實驗。取2μg RNA，按照TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix 說明書進行逆轉錄反應，42℃ 30min；85℃ 5 min。然后用ABI StepOne PlusTMReal Time PCR進行PCR反應，取2.0μL逆轉錄反應產物作為PCR反應模板，加入上下游引物20μmol/L各0.5μL，Fast SYBR@Green Master Mix 10μL，補充Rase-free water至20μL。反應參數：95℃ 20s預變性，95℃ 3S變性，60℃ 30s退火，共40個循環。每次擴增設置β-actin 作為內參照，進行PCR擴增產物的實時定量分析，用2-(△△Ct)方法分析。特異性引物序列見表1。

表1　Real Time PCR用的特異性引物序列

1.6統計學分析

利用板栗花富含黃酮類化合物的特點，以及黃酮類物質的抗氧化作用，通過提取、分離精制，生產黃酮含量高的制劑，進而與其他食品或助劑配伍，開發板栗花保健食品；利用黃酮、多酚類物質對皮膚的美白等保健功能，可以開發板栗花美白化妝品，如乳液、膏霜、水劑、面膜等；通過板栗花抑菌能力追蹤研究，提取或分離出抗抑菌能力強的成分或成分組合，開發板栗花天然抗菌藥品，減少人們對抗生素的依賴。

2結果

2.1大鼠Longa評分

假手術組﹑模型組﹑PNS組和尼莫地平組的Longa評分分別為0﹑(3.0±0.73)﹑(0.79±0.62)﹑(0.65±0.76)分。除假手術組無神經行為缺損癥狀外，其他各組大鼠則顯示出不同程度的神經行為缺損癥狀。與假手術組相比，模型組的神經缺損評分表現較高，差異有顯著的統計學意義(P<0.05)。與模型組相比， PNS組和尼莫地平組的神經缺損評分表現都有所降低P<0.05。

2.2大鼠腦組織TTC染色

與假手術組比較，模型組大鼠大腦有明顯的腦梗死面積。與模型組比較， PNS組和尼莫地平組的大鼠大腦腦梗死面積不明顯。

2.3VEGF免疫組化結果

如圖1所示，假手術組大鼠的皮質、海馬和皮質下結構中VEGF蛋白呈弱陽性表達。與假手術組比較，模型組的缺血半暗區有較多的神經細胞、膠質細胞和內皮細胞表達VEGF蛋白。和模型組比較，模型+PNS組和模型+尼莫地平組的VEGF蛋白表達明顯增強。

圖1 實驗組VEGF免疫組化結果(ABC，×400)

圖2　PNS對大鼠大腦缺血再灌注VEGF mRNA水平表達的影響

如圖2所示，相較于假手術組，模型組大鼠大腦VEGF的 mRNA表達水平升高明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。相較于模型組， PNS組和尼莫地平組的大鼠大腦VEGF的 mRNA表達水平升高明顯，具有統計學差異(P<0.05)。

3討論

VEGF是促進血管增生的重要因子，其生物學功能及在腦梗塞治療中的重要作用已逐漸被人們關注。VEGF 可促使微血管通透性增加，有助于促進在完全阻塞血栓中產生再通血管，促進周圍側枝循環建立和改善內皮細胞依賴性血管舒張，從而在缺血性腦血管疾病的治療中發揮重要作用[8]。在正常生理條件下，VEGF mRNA僅在正常血管內皮細胞中表達且水平甚低，而在缺血性腦血管病如腦梗塞時，梗死灶及缺血半暗帶中VEGF mRNA表達增高[9]。Hayashi 等[10]用免疫組化方法研究了大鼠MCAO后VEGF蛋白表達，發現缺血90min、再灌注1h供血區皮質部分神經元胞漿可見VEGF表達。

本實驗以PNS臨床劑量預處理大鼠7d，經缺血再灌注后觀察各組大鼠神經功能評分和大鼠大腦TTC染色，并從VEGF的角度觀察其免疫組化和mRNA水平表達情況，初步探討PNS預處理大鼠后，對缺血再灌住后的生理和對VEGF的影響。結果顯示，模型組的神經功能學評分顯著高于假手術組，缺血再灌注模型成功。相較于模型組，PNS組和尼莫地平組的神經缺損評分表現都有所降低，說明對于大鼠大腦的缺血再灌注損傷，PNS可有顯著的改善作用。相較于模型組，PNS組和尼莫地平組的大鼠大腦腦梗死面積并不明顯，說明預給予PNS，可以顯著減輕腦梗死面積。這與文獻[11]報道一致。

從VEGF的角度，免疫組化結果表明模型組的缺血半暗區有較多的神經細胞、膠質細胞和內皮細胞表達VEGF蛋白。相較于模型組，PNS組和尼莫地平組的VEGF蛋白表達增強較明顯。在mRNA水平，模型組大鼠大腦VEGF的 mRNA表達水平明顯升高。相較于模型組，PNS組和尼莫地平組的大鼠大腦腦VEGF的 mRNA表達水平升高明顯。

綜上所述，PNS可以改善大鼠大腦缺血再灌注引起的損傷，并且可以增強VEGF mRNA水平的表達。故初步推測三七總皂可能是通過上調缺血區腦組織血管內皮細胞表面VEGF mRNA的表達，促進缺血區新生血管形成，恢復缺血區腦組織及神經細胞血流供應，而起到治療腦缺血再灌注損傷及減輕恢復期功能障礙的作用，對其臨床療效有一定的指導意義。至于PNS究竟通過何種途徑激活并上調VEGF mRNA的表達，其確切機制尚不十分清楚，還有待日后進一步研究。

[參考文獻]

[1]Li X Y, Wang G G, Sun J G, et al. Pharmacokinetic and absolute bioavailability study of total panax notoginsenoside, a typical multiple constituent traditional Chinese medicine (TCM) in rats [J]. Biol Pharm Bull, 2007, 30(5): 847～851.

[2] 李曉宇, 孫建國, 鄭媛婷, 等. PNS對抗pO2 所致大鼠腦微血管內皮細胞損傷的物質基礎研究[J]. 中國藥理學通報, 2007, 23(8): 1030～1034.

[3] 吳穎, 孫冰, 肖靜, 等. 三七皂苷R1對LPS誘導的小鼠心肌損傷的保護作用[J]. 中國藥理學通報, 2013, 29(2): 179～184.

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[6] 韓若東, 湯其強, 肖晗, 等. 丹參酮 ⅡA對早期腦缺血和腦缺血再灌注損傷的腦保護作用[J]. 安徽醫科大學學報, 2012, 47(6): 655～658.

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[9] 崔常香, 孔立紅, 周紅娟, 等. 穴位埋線對腦缺血再灌注大鼠皮質區VEGF mRNA表達的影響[J]. 湖北中醫學院學報, 2010, 12(4): 21～23.

[10] Hayashi T, Abe K, Suzuki H, et al. Rapid induction of vascular endothelial growth factor gene expression after transient middle cerebral artery occlusion in rats [J]. Stroke, 1997, 28: 2039～2044.

[11]王海芳. PNS保護腦缺血再灌注腦損傷機制的實驗研究進展[J].山西中醫學院學報, 2014, 15(2): 73～75.

[編輯]劉陽

[文獻標志碼]A

[文章編號]1673-1409(2015)12-0001-04

[中圖分類號]R363

[作者簡介]蔣會慧(1978-)，女，講師，主要從事血管藥理學研究工作， bzyhuli@126.com。

[收稿日期]2015-01-05

[引著格式]蔣會慧,王園園,劉立富,等. 三七總皂苷對大鼠大腦缺血再灌注VEGF表達的影響[J]. 長江大學學報(自科版)，2015，12(6)：1~4.