腫瘤血管抑制劑XY-02與CA4P的組織分布比較研究

寧 欣，陳芙蓉，張玉霞，馮亞男，王夢麗，謝紅英，雍智全，徐小平

（1.四川大學華西藥學院，四川 成都 610041；2.廣東達信生物科技有限公司，廣東 東莞 523808）

腫瘤血管抑制劑XY-02與CA4P的組織分布比較研究

寧 欣1，陳芙蓉1，張玉霞1，馮亞男1，王夢麗1，謝紅英1，雍智全2，徐小平1

（1.四川大學華西藥學院，四川 成都 610041；2.廣東達信生物科技有限公司，廣東 東莞 523808）

建立HPLC對腫瘤血管抑制劑XY-02與CA4P在大鼠體內組織分布規律的研究方法，揭示兩種藥物靶組織的差異與潛在的治療特征和安全性。SD大鼠分別靜脈注射XY-02（80mg/kg)或CA4P（1mg/kg)，于給藥后15，40，90min采集大鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、腦、子宮、睪丸等組織進行含量測定，以C18（250mm×4.6mm×5μm)為色譜柱，0.01%乙酸-甲醇（50∶50，ν/ν)為流動相，流量為1.0mL/min，檢測波長為325nm。XY-02和CA4P分別在0.15～750μg/mL和0.03～60μg/mL范圍內線性關系良好（r＞0.9995)，檢測限分別為17ng/mL和4.93ng/mL。兩種腫瘤血管抑制劑均在大鼠組織中有廣泛分布和快速消除的特點，預示二者可對各種組織腫瘤具有潛在的治療作用且體內產生蓄積的可能性小。特別是XY-02在腎臟和肝臟中分布較多，提示XY-02可對臨床上較難治療的腎癌和肝癌有更好的治療價值；XY-02在心臟和腸道的分布較CA4P低，表明XY-02的心臟毒性和腸道的不良反應比CA4P更小，安全性更好。

XY-02；CA4P；靜脈給藥；HPLC；組織分布

0 引言

XY-02，化學名為（E）-3-（3′-羥基-4′-甲氧苯基）-2-（3′，4′，5′-三甲氧苯基）丙烯酸叔丁銨鹽，中文名為康丁胺；CA4P，化學名為2-甲氧基-5-[（1Z）-2-（3，4，5-三甲氧基苯基）乙烯]苯酚磷酸酯二鈉，中文名為康普瑞丁磷酸二鈉鹽[1-2]皆為腫瘤血管抑制劑Combretastatin類化合物的同系物。Combretastatin類化合物系從南非灌木Combretum Caffrum的樹皮中分離得到的一類具有順式二苯乙烯結構的天然產物[3-4]，20世紀90年代，獲得其全合成產品，后經結構修飾獲得從CA1～CA32的系列化物，其中最具生物活性的主要有CA1和CA4。其作用原理為靶向作用于腫瘤血管異常增生的內皮細胞，誘導增生的內皮細胞出現炎癥樣反應，引起細胞凋亡和血管壁萎縮，切斷通向腫瘤的血流供應，使腫瘤發生“饑餓性”壞死，達到抑制腫瘤生長的目的[5-6]。然而這類化合物最大的缺陷是水溶性極差，難以制劑成型，所以前期將CA4經磷酸酯化后形成二鈉鹽作為前體藥物CA4P，CA4P在體內經磷酸酯酶水解出母體CA4而發揮抑瘤作用[7]。目前，CA4P已經進入臨床II期試驗，正在進行單獨治療或與紫杉醇、卡鉑聯合治療晚期癌癥的臨床試驗[8-10]。CA4P的結構如圖1（a）所示。即使CA4P具有一定水溶性，其水解后仍然是不溶于水的CA4，而且CA4P在水溶液中易發生順反式轉化，因此CA4P僅能制劑成凍干注射劑，限制了其向其他給藥途徑的制劑開發。

為克服CA4P前體水解后的CA4水溶極差的問題，XY-02通過組合化學優化出水溶性更好的XY-02化合物，化學結構如圖1（b）所示。藥理毒理試驗結果表明，XY-02與CA4P的療效相當，體內平均抑瘤率約70%，安全性更好（LD50為2g/kg）。良好的水溶性，使得XY-02可更廣泛地開發成各類制劑，特別是便于臨床使用的口服制劑。雖然關于XY-02和CA4P的藥物代謝動力學研究分別已有報道[11-13]，但在動物體內的相關組織分布，特別是二者組織分布比較的研究尚未見報道。為此，本文通過高效液相色譜法（HPLC）分別檢測XY-02和CA4P在大鼠各組織的濃度分布，比較其分布規律，并闡明其分布特征與藥效學和毒理學之間的潛在關系，為進一步研究開發和臨床應用提供組織分布的基礎依據。

圖1 XY-02和CA4P的化學結構圖

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

液相色譜儀系統LC-2010A（日本島津公司）；可見-紫外分光光度儀UV2300（上海天美科學儀器有限公司）；BT125D電子分析天平（Sartorius公司）；TGL-16G Anke飛鴿牌高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；GL-88B旋渦振蕩器（海門麒麟醫用儀器廠）；XHF-1內切式勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；純水儀。XY-02對照品和供試品（質量分數≥99.50%，自制）；內標1阿魏酸對照品（中國藥品生物制品檢定所）；CA4對照品、CA4P對照品和供試品（99%，自制）；內標2（E）-3-（4′-甲氧苯基）-2-（3′、4′、5′-三甲氧苯基）-2-丙烯酸（質量分數≥99%，自制）；甲醇（色譜純，FISHER）；乙腈（色譜純，FISHER）；高氯酸、甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸等其他化學試劑均為分析純；超純水（自制）。

1.2 動 物

成年健康SD大鼠，雌雄兼用，體重（170±20）g，由四川大學實驗動物中心提供。飼養于四川大學實驗動物中心普通小動物房，雌雄分籠；飼養條件符合GB 14925——2001《實驗動物 環境及設施》。環境溫度（19±3）℃，濕度55%±15%。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Aichrom band-AQ C18（250mm×4.6mm× 5μm）；流動相:0.01%乙酸-甲醇（50∶50，ν/ν)；流量為1.0 mL/min；檢測波長為325 nm；柱溫為35℃；進樣量為20μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 XY-02、CA4P對照品儲備溶液的制備

精密稱取XY-02對照品18.8mg于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質量濃度為750 μg/mL的XY-02對照品儲備液。精密稱取CA4P對照品15.0 mg于25 mL量瓶中，加甲醇溶液溶解稀釋至刻度，搖勻，制得質量濃度為600 μg/mL的CA4P對照品儲備液。于冰箱約4℃存放。

2.2.2 內標液的制備

精密稱取內標1對照品13.1 mg于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，制得質量濃度為5.24μg/mL的內標1溶液。于冰箱約4℃存放。

精密稱取內標2對照品10.3 mg，置于10 mL容量瓶加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，制得質量濃度為1.03μg/mL的內標2溶液。于冰箱約4℃存放。

2.3 樣品的處理

取大鼠各組織勻漿100 μL，置于1.5 mL離心管中，加入內標1（5.24 μg/mL）100 μL或內標2（1.03 μg/mL）100 μL，加入10%高氯酸100 μL，渦旋混合3 min，靜置，以12 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線

1）XY-02的標準曲線。取100μL空白心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、腦、睪丸、子宮組織勻漿液各8份，均分別加入0.15，0.75，3，15，75，150，375，750μg/mL的XY-02對照品溶液100μL（含內標1，5.24μg/mL），加入10%高氯酸100 μL，按“2.3”項下方法操作，制備出標準曲線溶液。

2）CA4的標準曲線。取空白大鼠各組織勻漿液各6份，均分別加入0.03，0.06，0.3，3，6，60μg/mL的CA4對照品溶液100μL（含內標2，1.03μg/mL），加入10%高氯酸100 μL，按“2.3”項下方法操作，制備出標準曲線溶液。

精密量取上述標準曲線溶液各20μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。以藥物與內標峰面積比（Y）對組織中藥物濃度（X）進行線性回歸，分別得各組織溶液的標準曲線回歸方程（見表1）。XY-02和CA4的線性范圍分別為0.15～750 μg/mL和0.03～60 μg/mL,均具有良好的線性關系（r＞0.9995）。

表1 XY-02和CA4的標準曲線

2.4.2 檢測限

以XY-02和CA4標準曲線系列溶液中最低質量濃度不斷稀釋進樣，按信噪比法，在S/N≥3時，XY-02和CA4檢測的最低質量濃度分別為17ng/mL和4.93ng/mL。

2.4.3 提取回收率

按“2.4.1”項下方法制備XY-02在大鼠脾組織中的低、中、高（0.75，15，150μg/mL)3個質量濃度或CA4在大鼠脾組織樣品中的低、中、高（0.03，3，6 μg/mL）3個質量濃度的QC樣品，每一梯度各制備3份，以提取后的色譜峰面積與未經提取直接進樣獲得的色譜峰面積之比，考察樣品的提取回收率。低、中、高3個質量濃度的脾組織勻漿液中XY-02的萃取回收率分別為98.72%，98.83%，99.69%，CA4的萃取回收率分別為96.39%，96.69%，97.66%，滿足生物樣品提取測定的要求。

2.4.4 準確度和精密度考察

取空白脾組織勻漿液30份，按“2.4.3”項下方法制備含XY-02或CA4低、中、高3個質量濃度的QC樣品，每個梯度各5份，以標準曲線計算各樣品中XY-02或CA4P的含量，并與加入量比較，計算組織中XY-02或CA4的加樣回收率。于同一日內和不同日操作及測定，計算脾組織勻漿液中XY-02或CA4濃度的日內和日間精密度。

結果表明，高、中、低3組樣品中XY-02或CA4的加樣回收率均大于95%；XY-02的日內和日間精密度分別小于0.63%和0.57%，CA4日內和日間精密度分別小于2.42%和2.37%，測定結果的精密度良好。

2.4.5 穩定性考察

取組織樣品，考察XY-02勻漿樣品和CA4勻漿樣品在-20℃冷凍14d、7次凍融循環和預處理后于室溫下放置在進樣架48h的穩定性。XY-02樣品與CA4在這3種條件下的的剩余百分率分別依次為95.81%、94.52%、92.71%和99.50%、97.53%、93.23%。結果表明，XY-02和CA4組織樣品于室溫放置48h、-20℃下冷凍14d及凍融7次均穩定。

2.5 組織樣品的采集

取SD大鼠，分為3個時間組，每組6只，給藥前禁食12 h，靜脈注射XY-02（80 mg/kg）或CA4P（1 mg/kg）。分別于給藥后15，40，90 min時處死動物，采集大鼠各組織（心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、腦、睪丸、子宮）。用純水清洗組織表面血跡，用濾紙蘸干，稱定各組織質量，再分取組織樣品約0.6 g，精密稱定，加2倍水制成各組織勻漿（剩余組織于-20℃凍存）。

2.6 組織樣品的測定

取各組織勻漿適量，按“2.3”項下方法制備各組織供試品溶液，分別精密量取各組織供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。采用內標法，以隨行標準曲線計算組織中XY-02或CA4的含量，并換算成每1g組織含XY-02或CA4的量。各組織中XY-02與CA4的含量（μg/g）測定結果見表2。XY-02與CA4分別在各組織中的分布情況如圖2、圖3所示。由于XY-02與CA4P的安全范圍不同，CA4P的毒性較大，所以實驗中二者的給藥劑量不同，其中XY-02為80mg/kg，而CA4P為1mg/kg。為便于對兩種藥在同一劑量水平比較其組織中的分布規律，通過換算各組織中XY-02或CA4P的含量分別占給藥量的百分比（%）來體現二者的分布特點，并對靜脈注射給藥15min后，XY-02與CA4P在大鼠各組織中的分布（%）結果進行比較，如圖4所示。

圖2 大鼠注射80mg/kg XY-02組織分布圖

圖3 大鼠注射1mg/kg CA4組織分布圖

圖4 15min大鼠各組織中XY-02與CA4分布比較

3 討 論

根據CA4P為CA4的前體藥物的性質，靜脈注射CA4P后，在體內迅速脫磷酸酯成CA4，因此本實驗通過測定CA4在各組織中的濃度，來考察CA4P在各組織中的分布規律。

結果表明，靜脈注射XY-02或CA4P后，二者均具有分布廣泛的特征，其中XY-02在15min內達到最大組織分布量，并且隨著時間的增長，組織濃度逐漸下降，90min后接近或低于檢測限。CA4P在15min內除睪丸未達到峰值，其他組織中CA4P的濃度均達到峰值，并且隨之逐漸減少，到90 min后基本消除完全。提示二者的分布消除速度均較快，產生藥物蓄積的可能性較小。

表2 不同時間XY-02與CA4的大鼠組織分布濃度

由圖2可知，XY-02在大鼠各組織中分布順序為腎＞子宮＞肝＞胃＞肺＞心臟＞脾＞腸＞腦＞睪丸。其中腎臟分布最高，與XY-02以尿路排泄為主相吻合，其次是在子宮中也表現出較高的含量，同時肝臟中分布也較高，有利于腎癌、宮頸癌和肝癌的治療。由圖3可知，CA4P水解后的CA4在大鼠各組織中分布順序為心臟＞腸＞肺＞脾＞肝＞腎＞胃＞腦＞子宮＞睪丸。

由圖4可知，XY-02在肝、腎、胃、肺、子宮、睪丸的分布明顯高于CA4，提示XY-02對肝癌、肺癌和胃癌等實體瘤的治療作用可能更優于CA4P。而值得注意的另一方面，CA4P在小腸中的分布明顯高于XY-02，作為本類血管抑制劑的毒性靶器官，可預示CA4P引起腸道副反應，如腹瀉、惡心、嘔吐等將比XY-02更嚴重；同時CA4P在心臟中的分布明顯高于XY-02，闡明了XY-02對心臟的毒性更小，由此引起的心悸和頭暈等癥狀更輕。

4 結束語

本文在首次研究XY-02的大鼠組織分布中，發現XY-02在大鼠組織中廣泛分布，在腎臟、子宮、肝臟、肺和胃組織中高分布特點，預示XY-02有利于臨床上較難治療腎癌、肝癌等的治療；經與CA4P的組織分布比較，發現XY-02在心臟和腸道中的分布明顯低于CA4P的分布，提示XY-02可減輕CA4P的心臟毒性和下消化道不良反應，具有更高的安全性。

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Comparisons of tissue distribution of tumor vascular inhibitors XY-02 and CA4P

NING Xin1，CHEN Furong1,ZHANG Yuxia1,FENG Ya’nan1，WANG Mengli1，XIE Hongying1，YONG Zhiquan2，XU Xiaoping1
（1.West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China；2.Dongguan Daxin Biotech Co.，Ltd.，Dongguan 523808，China）

A HPLC method was developed for the comparative study of the tissue distribution of CA4P and XY-02 in rats.The test revealed the differences in target tissues as well as the potentialtreatmentand safety features ofthe two tumorvasculartargeting inhibitors.After intravenous administration of XY-02（80 mg/kg）or CA4P（1 mg/kg），samples like heart，liver，spleen，lung，stomach，intestine，brain，testis，uterus were taken at 15，40，and 90 min after dosing.The separation was performed on a ODS column（250 mm×4.6 mm×5 μm）with mobile phase methanol-0.01%acetic acid（50:50，ν/ν）.The wavelength was set at 325nm and the flow rate was 1 ml/min.Calibration standards show that the excellent linearity range is 0.15-750 μg/mL for XY-02 and 0.03-60.0μg/mL for CA4P（r＞0.9995）.The lowest detectable concentration of XY-02 and CA4P is 17ng/mL and 4.93ng/mL，respectively.The results indicate that both XY-02 and CA4P are widely distributed and rapidly eliminated in tissues，suggesting that they may have potential treatment effect in vivo tumors in different tissues and the possibility of accumulation in vivo is little.The relatively high distribution of XY-02 in kidney and liver demonstrates that it may have a better value in treating kidney and liver cancers.Compared with CA4P，XY-02 is lower in cardiotoxicity and gastrointestinal adverse reaction and much safer.

XY-02；CA4P；intravenous administration；HPLC；tissue distribution

A

：1674-5124（2015）10-0053-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.10.012

2015-04-15；

：2015-05-28

2014年東莞市引進創新創業領軍人（201476815)

寧 欣（1991-)，女，四川綿陽市人，碩士研究生，專業方向為藥品質量控制和藥物代謝分析。