孕馬尿中3種主要結合雌激素含量一測多評新方法研究

姚 軍李東雨張煌濤鹿 毅高曉黎

（1.新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾自治區產品質量監督檢驗研究院，新疆 烏魯木齊 830004）

孕馬尿中3種主要結合雌激素含量一測多評新方法研究

姚 軍1，2，李東雨1，張煌濤2，鹿 毅2，高曉黎1

（1.新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾自治區產品質量監督檢驗研究院，新疆 烏魯木齊 830004）

建立基于質譜檢測的一測多評（QAMS)測定孕馬尿中3種主要結合雌激素方法。樣品經大孔吸附樹脂固相萃取小柱凈化，利用HPLC-MS進行檢測，以雌酮硫酸鈉為內標，測定馬烯雌酮硫酸鈉及17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的相對校正因子，進行3種成分的含量測定。結果表明，3種成分的線性、精密度、穩定性及回收率均較好。馬烯雌酮硫酸鈉及17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的相對校正因子分別為0.8663和0.9884。色譜柱、碎片電壓等均對校正因子影響較小，兩種方法測定10批孕馬尿樣品中的3種結合雌激素含量，無顯著性差異，該方法在測定孕馬尿中3種主要結合雌激素方面有更大的優勢。

結合雌激素；一測多評；LC-MS；相對校正因子

0 引 言

孕馬結合雌激素作為激素補充療法（hormonere placement therapy，HRT)的重要藥物已經得到普遍應用[1]，惠氏制藥公司生成的倍美力、倍美安、倍美盈等藥物中雌激素均為從孕馬尿中獲得。孕馬雌激素是一類雌激素硫酸鈉鹽的混合物，被稱為結合雌激素（conjugated estrogens，CE)，種類較多，其中以雌酮硫酸鈉（sodium estrone sulfate，ES)、馬烯雌酮硫酸鈉（sodium equilin sulfate，EqS)、17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉（sodium 17α-dihydroequilin sulfate，17α-EqS)為主，3者占結合雌激素總含量的90%以上，這3種成分是美國藥典及歐盟藥典作為孕馬CE藥物含量測定的質控成分[2]。

新疆伊犁河谷是我國馬匹資源最為豐富的地區，當地數量眾多的孕馬資源使得提取孕馬CE成為可能，在伊犁河谷已經有制藥企業研發CE藥物。在孕馬尿原料、中間體、原料藥及制劑等含量檢測方面均需要測定其中主要的結合雌激素，但由于CE對照品合成困難，均需要從國外購買，售價高昂，尤其是EqS、17α-EqS的獲得更為困難；因此，一測多評成為解決對照品短缺的方法之一。本課題組已經建立了一測多評HPLC-UV法測定孕馬尿中主要CE的方法[3]，但由于馬尿樣品成分復雜，在實際檢測過程中發現部分馬尿樣品中這3種主要待測組分分離不佳，存在定量誤差較大、定性不可靠的情況，使得該方法在實際應用方面受到限制，這也是復雜樣品中利用HPLC-UV一測多評方法的不足之處。本實驗建立的基于MS檢測的一測多評新方法能夠很好地解決以上問題，在實際檢測過程具有更大的優勢。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1100型LC-MS聯用儀（1100型高效液相系統，G1946C四級桿質譜檢測器，配大氣壓電離源及電噴霧電離源，Agilent科技有限公司)；AB135-S電子分析天平（梅特勒托利多公司)；HERAEUS MULTIFUGE X3R高速冷凍離心機（Thermo scientific公司)；Milli-Q超純水處理系統（Millipore公司)。

乙腈為色譜純；醋酸銨為優級純；乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉均為分析純；超純水（≥18.2mΩ)；大孔樹脂 （上海摩速公司，HPD-400型)；ES、EqS及17α-EqS對照品（新疆新姿源生物制藥公司提供，純度≥99.0%)；10批孕馬尿樣品來自新疆伊犁新源縣土爾根鄉牧戶，均為懷孕母馬尿液，編號1#～10#。

1.2 方法原理

一測多評法（quantitative analysis of multi-components with single marker，QAMS)是指在多指標質量評價時，以藥材中某一典型組分為內標，測定該成分與其他成分間的相對校正因子，通過相對校正因子計算其他成分含量，各成分相對校正因子計算公式如下：fks=fk/fs=Wk×As/（Ws×Ak)（式中Wk為內標物濃度；Ak為內標物面積；Ws為組分S的濃度；As為組分S的峰面積)[4]。本實驗采用MS作為檢測器，以ES為內標，測定EqS及17α-EqS的相對校正因子并計算其含量。該方法測定的原理是基于3種CE化學結構相似，如圖1所示，在一定碎片電壓下采用ESI源、負離子模式，其產生準分子離子[M-Na+]的能力相似。在一定條件下各組分校正因子為一相對固定值。

圖1 ES、EqS、17α-EqS化學結構

1.3 溶液制備

1.3.1 結合雌激素對照品溶液制備

精密稱取ES、EqS和17α-EqS對照品適量，用50%的甲醇水溶液配制成質量濃度分別為300，150，100μg/mL的儲備液。精密吸取上述3種對照品儲備液各2.00mL，置于同一50mL量瓶中，50%甲醇水溶液定容，制得ES、EqS、17α-EqS濃度分別為12.00，6.00，4.00 μg/mL的混合對照品溶液，分別精密吸取上述混合對照品溶液0.2，1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL置于10mL量瓶中，50%甲醇水溶液定容，作為混合對照品系列標準溶液。

1.3.2 供試品溶液制備

固相萃取小柱：取5mL注射器管，1.0g HPD-400大孔吸附樹脂干法裝填，5 mL無水乙醇活化，之后5mL純水，重力作用下洗脫。

取5 mL孕馬尿于高速離心機5 000 r/min離心5min，精密吸取上清液1.00mL，緩慢滴入固相萃取小柱中，用4mL 5%NaCl溶液淋洗，再用4mL 1.5% NaOH溶液淋洗，棄去流出液，再用乙醇洗脫并收集流出液至10mL，搖勻，過0.22μm濾膜，作為孕馬尿供試品溶液。

1.4 色譜、質譜檢測條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6mm×150mm×5μm)；以乙腈-0.01mol/L醋酸銨（30∶70，ν/ν)為流動相；柱溫為35℃；流量為1.0mL/min，柱后分流：分流比2∶3，0.4 mL/min進質譜；進樣體積：10μL。

采用選擇離子（SIM)掃描模式，選擇m/z349，347；ESI離子源；負離子檢測；碎片電壓：80V；霧化氣（N2)壓力為35 psi（1 psi=6.895 kPa)，干燥氣（N2)流量10.0 mL/min，干燥氣溫度350℃，毛細管電壓3500V。

在該條件下，對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品（不含3種CE的馬尿)的總離子流圖（TIC)見圖2，由SIM的總離子流圖可以看出，由于只選擇ES、EqS及17α-EqS的特征碎片離子的質荷比m/z為349、347、349，3種主要CE的分離情況較好，分離度＞1.5，陰性樣品無干擾。如果檢測過程隨柱效降低，EqS和ES無法基線分離，可以采用在TIC圖中進行提取離子色譜（EIC)進行處理，能夠得到各組分準確峰面積，而孕馬尿中其他成分不會產生干擾。

2 結果與討論

2.1 結果

2.1.1 線性方程

分別取“1.3.1”項下系列標準溶液10 μL進樣，按“1.4”項下條件檢測，以測得的峰面積與被測物的質量濃度（μg/mL)進行線性回歸，得ES、EqS、17α-EqS的線性方程及線性范圍如表1所示。結果表明3種CE線性良好。

2.1.2 精密度試驗

另制備 ES、EqS、17α-EqS質量濃度分別為200，100，75μg/mL的混合儲備液，稀釋為質量濃度分別為8.00，4.00，3.00 μg/mL的ES、EqS、17α-EqS混合對照品溶液，進樣5μL，重復進樣6次，記錄峰面積。結果ES、EqS、17α-EqS峰面積的RSD分別為1.18%，1.15%，1.08%。

表1 線性方程和線性范圍

圖2 對照品、供試品、陰性樣品的總離子流（TIC)圖

2.1.3 穩定性試驗

取批號為1#孕馬尿樣品處理后的供試品溶液，分別于0，3，6，9，12，24h進樣，記錄峰面積。結果ES、EqS、17α-EqS峰面積的RSD分別為1.82%、2.11%、1.73%。

2.1.4 重復性試驗

取批號為1#孕馬尿樣品按“1.3.2”項下方法制備供試品6份，分別進樣5μL，記錄峰面積，計算含量，結果ES、EqS、17α-EqS含量平均值（n=6)分別為89.8，23.5，15.7μg/mL；RSD分別為0.70%、2.18%、1.92%。

2.1.5 加樣回收率試驗

取已知含量批號為1#的孕馬尿樣品9份，每份5 mL，每3份為一組，置于10 mL容量瓶中，按高、中、低加入量分別加入ES、EqS、17α-EqS質量濃度為200，100，75μg/mL的儲備液溶液各0.50，1.00，1.50mL后混勻，用純水定容，混勻，在“1.4”項色譜條件下測定，計算ES、EqS、17α-EqS的平均回收率，平均回收率分別為96.3%、95.7%和94.9%。

2.1.6 基質效應的考察

取“2.1.2”中ES、EqS、17α-EqS分別為8.00，4.00，3.00μg/mL的待測液；按“1.4”方法下測定，3種CE在上述兩種基質中的峰面積分別為A1、A2、A3和B1、B2、B3，機制效應ME（%)=A/B×100%，基質效應在93%～109%，說明基質效應影響較小。

2.1.7 相對校正因子的確定

1)CE相對校正因子的測定。取“1.3.1”項下系列標準溶液按“1.4”項下條件進樣10μL，測定各組分的峰面積。分別測定10次，根據“1.2”項下公式分別計算EqS、17α-EqS與ES的相對校正因子，結果見表2。

表2 EqS、17α-EqS與ES的相對校正因子

2)相對校正因子重復性考察。取“2.1.2”儲備液制備ES、EqS、17α-EqS質量濃度為1.60，0.80，0.60μg/mL的CE對照品溶液6份，分別進樣2，4，6，8，10μL，測定EqS、17α-EqS的相對校正因子分別為0.869 3，0.992 0，RSD分別為 1.20%、1.92%，表明 EqS、17α-EqS相對校正因子重復性良好。

3)不同色譜柱對校正因子的影響。采用Agilent Eclipse XDB-C18、DiKMA Diamonsil C18、YMC-Pack ODS，均為4.6mm×150mm×5μm色譜柱，取ES、EqS、17α-EqS濃度分別為1.60，0.80，0.60μg/mL的CE對照品溶液6份，進行測定，測得EqS、17α-EqS的相對校正因子分別為0.8618，0.9830，RSD分別為1.80%、2.20%，表明EqS、17α-EqS相對校正因子重復性良好。

4)LC-MS碎片電壓對相對校正因子的影響。采用碎片電壓分別為70，75，80，85，90 V，取ES、EqS、17α-EqS濃度分別為1.60，0.80，0.60μg/mL的CE對照品溶液，測定EqS、17α-EqS的相對校正因子分別為0.867 2，0.978 9，RSD分別為2.10%、2.30%，表明EqS、17α-EqS相對校正因子重復性良好。

5)兩種方法的比較。取孕馬尿樣品1#～10#，共10批，采用本實驗建立一測多評方法進行測定，同時采用3種待測物的對照品外標法測定，兩種測定結果見表3，通過統計學檢驗，兩種方法的檢測結果無顯著性差異。

表3 10批樣品中3種CE的測定結果

2.2 討 論

2.2.1 前處理方法的建立

本實驗建立的大孔吸附樹脂為填料的SPE方法，適合孕馬尿樣品，加入5%的NaCl能夠使CE通過鹽析作用較好地被大孔吸附樹脂吸附，1.5%的NaOH溶液可以將馬尿中大量的酚類物質（如甲酚等)中和為鹽，被提前洗脫出去，最后用乙醇（或甲醇)洗脫待測物。

2.2.2 HPLC-UV一測多評方法的不足

本課題組建立了孕馬尿中3種結合雌激素的HPLC-UV一測多評方法[3]，部分馬尿樣品色譜圖見圖3，由圖可知3種主要CE對照品溶液色譜圖分離效果較好，而對于供試品，由于孕馬尿成分復雜，雖然經過SPE樣品前處理，但采用UV檢測，部分樣品的色譜圖中3種成分分離度不佳，無法進行準確的定性、定量，如果利用一測多評方法會產生較大的誤差。

圖3 HPLC-UV一測多評方法色譜圖

本實驗基于質譜檢測的總離子流圖（TIC)如圖2所示，由于采用選擇離子模式（SIM)掃描，只針對ES、EqS及17α-EqS進行測定，因此沒有其他物質干擾，分離效果好，專屬性強。

3 結束語

一測多評在中藥材及復雜樣品質量控制方面的應用越來越多[5]，目前文獻中采用的方法多基于HPLC-UV法進行測定，利用HPLC-UV方法進行一測多評所需儀器較為普及，測試成本較為低廉[6-8]。但定性方面采用相對保留時間進行定性，專屬性方面存在一些困難，盡管可以采用PDA檢測器進行驗證，但由于通常檢測的是一類化合物，紫外光譜差異較小，其作用有限。如果樣品成分復雜，由于分離不佳，待測化合物的定量和定性都會影響一測多評的準確性。本文建立的基于MS檢測的一測多評技術在樣品的專屬性、分離度方面有著明顯的優勢，對于復雜體系中結構較為相似的一類化合物采用一測多評方法提供了一種更為可靠的方法。

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經過計算得到：測試壓力為（300±5)kPa條件下，單件重復測量50次的平均值xˉ=0.38006，標準偏差s=0.0081，相對標準偏差RSD=2.1%。其相對標準偏差＜5%，證明該檢測方法重復性好。

4 結束語

基于二氧化碳傳感器的氣密性檢測方法，通過高準確度氣敏傳感器的濃度檢測實現氣體微量泄漏的快速、高效、高準確度檢測，實驗結果表明實測值與標準漏孔參考值誤差均小于3%，檢測結果準確可靠。在相同壓力測試條件下，測試結果的相對標準偏差＜5%，實驗重復性好，提高了氣密性檢測方法的多樣性和準確度。檢測方法優良的設計和可靠的性能，為提高生產效率和提升氣密性檢測準確度發揮了重要作用，具有廣闊的應用前景。

參考文獻

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Study on the contents of three main conjugated estrogens in the pregnant mare’s urine using a new method of QAMS

YAO Jun1，2，LI Dongyu1，ZHANG Huangtao2，LU Yi2，GAO Xiaoli1
（1.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；2.Xinjiang Uygur Autonomous Region Product Quality Supervision and Inspection Institute，Urumqi 830004，China）

The purpose of this paper is to establish the Quantitative Analysis of Multi-Components by Single Marker（QAMS）to determine the contents of three main conjugated estrogens in pregnantmares'urine based on mass spectrometry analysis.Samples were purified by a macroporous adsorption resin solid-phase extraction column and then detected by HPLC-MS.The relative correction factors in sodium equilin sulfate and sodium 17α-dihydroequilin sulfate were determined using sodium estrone sulfate as the internalstandard to assay the three main conjugated estrogens.The results show that the three main components are good in linear and precision，stability and recovery.The relative correction factors of sodium equilin sulfate and sodium 17α-dihydroequilin sulfate were 0.8663 and 0.9884 respectively.The chromatographic column and fragmentation voltage have little effect on the relative correction factors.There are no significant differencesin determining the three main conjugated estrogens in ten batchesof pregnant mares'urine samples.Therefore，this method has greater advantages in determining pregnant conjugated estrogens described in above.

conjugated estrogens；QAMS;LC-MS；relative correction factor

A

：1674-5124（2015）10-0058-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.10.013

2015-05-14；

：2015-06-30

新疆維吾爾自治區自然科學基金（2013211A054)

姚 軍（1973-)，男，新疆烏魯木齊市人，副教授，研究方向為藥物分析。