羊口瘡病毒新疆流行株的分離鑒定及其遺傳進化分析

楊海波，孟慶玲，喬 軍，才學鵬，賀志昊，劉昱成，彭葉龍，王國超，陳創夫，都曼·努爾坎杰

(1 石河子大學 動物科技學院 動物疾病防控兵團重點實驗室，新疆 石河子 832003；2 中國農業科學院 蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730046;3 沙灣縣畜牧獸醫站，新疆 沙灣 832100)

羊口瘡病毒新疆流行株的分離鑒定及其遺傳進化分析

楊海波1，孟慶玲1，喬 軍1，才學鵬2，賀志昊1，劉昱成1，彭葉龍1，王國超1，陳創夫1，都曼·努爾坎杰3

(1 石河子大學 動物科技學院 動物疾病防控兵團重點實驗室，新疆 石河子 832003；2 中國農業科學院 蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730046;3 沙灣縣畜牧獸醫站，新疆 沙灣 832100)

【目的】 研究羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)新疆流行株的遺傳變異情況?！痉椒ā?采集新疆石河子地區疑似感染ORFV的羔羊唇部結痂病料，通過PCR擴增、Vero傳代細胞分離培養、電鏡觀察、動物回歸試驗等方法，檢測、分離和鑒定ORFV毒株，對分離鑒定的3株ORFV毒株保護性抗原基因B2L和F1L及毒力基因VIR、GIF和VEGF分別進行克隆、測序及遺傳進化分析?！窘Y果】 從病料中分離鑒定出3株ORFV新疆流行株(ORFV-SHZ1、ORFV-SHZ2和ORFV-SHZ3)。分析結果顯示，ORFV分離株保護性抗原基因B2L、F1L相對保守，B2L和F1L基因編碼氨基酸序列與其他參考株的同源性分別為88.6%～97.9%和86.7%～97.4%；3個毒力基因的變異相對較大，尤其是VEGF基因。VIR、GIF和VEGF基因編碼氨基酸序列與其他參考株的同源性分別為91.8%～97.3%，85.2%～97.0%和71.5%～98.5%?；贐2L和VIR基因的遺傳進化樹分析表明，ORFV-SHZ1和ORFV-SHZ2分離株均與臺灣分離株的親緣關系最近?！窘Y論】 試驗分離的ORFV新疆流行株可能是由臺灣株與其他毒株重組后產生的，且其毒力基因發生了較大的變異。

羊口瘡病毒；分離鑒定；遺傳進化分析；新疆

羊口瘡又稱羊接觸傳染性膿皰皮炎或傳染性膿瘡，是由羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)所引起的一種綿羊和山羊的接觸性傳染病。該病毒為雙鏈DNA病毒，基因組長約140 kb，G+C含量達64%[1]，是痘病毒科、副痘病毒屬的代表種。副痘病毒屬成員還包括小牛侵蝕性口炎病毒(Bovine pustular stomatitis virus，BPSV)、偽牛痘病毒(Pseudo-cowpox virus，PCPV)和新西蘭紅鹿副痘病毒(Parapox virus of red deer in New Zealand，PVNZ)[2-3]。

ORFV主要感染小反芻動物如山羊和綿羊，偶爾也感染其他野生反芻動物，如鹿、麝牛等，其中以羔羊最為易感，常引起群體發病，尤其是飼養密集的羊群[4]，口瘡的臨床特征是在唇部、舌、鼻端、乳房等部位形成丘疹、水皰、膿皰和痂皮。此外，本病是一種人獸共患傳染病，可通過直接接觸感染人[5]。據報道，該病發病率接近50%，敏感羊群的發病率則可接近90%，因此一旦發生該病，在給養羊業造成巨大經濟損失的同時也直接威脅著人類的健康。

疫苗接種是預防和控制口瘡病發生的有效手段。然而，近年來有研究報道弱毒疫苗免疫后，不能提供有效的保護，出現免疫失敗和重復感染的現象，推測不同地域ORFV流行株存在遺傳變異。養羊業一直是新疆牧民的主要產業，近年來，隨著養殖規模的擴大和飼養方式的轉變，羊口瘡在新疆各地羊群中呈暴發性流行，在易感羊群中發病率可達90%，羔羊感染后的死亡率可達30%以上[6]，給新疆養羊業造成了較大的經濟損失。本研究對在新疆石河子地區分離出的3株ORFV的2個保護性抗原基因和3個毒力基因分別進行克隆、測序及遺傳進化分析，旨在從分子水平上揭示ORFV新疆流行株的遺傳變異規律，為新疆地區ORFV的科學防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病料的采集與處理 于2012-06-2013-07在新疆石河子市周邊羊場采集3～4月齡疑似發生口瘡病羔羊的唇部結痂及口腔黏液備用。

對采集的山羊口唇處痂塊用無菌生理鹽水漂洗3次后剪碎、研磨并以無菌生理鹽水按體積比為 1∶10 制成懸液，加青霉素、鏈霉素各2 000 IU/mL,置4 ℃冰箱過夜,以5 000 r/min 離心10 min,取上清液用于后續試驗。

1.1.2 細胞系與菌株 Vero細胞和DH5α感受態細胞均由石河子大學動物疾病防控兵團重點實驗室保存。

1.1.3 主要試劑與儀器 主要試劑：胎牛血清和細胞培養基DMEM購自Hyclone公司，青霉素、鏈霉素、0.22 μm濾器、限制性內切酶SmaⅠ、T4 DNA 連接酶、PCR反應試劑、pMD18-T載體、總DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和DNA Marker均購自 TaKaRa 公司。

主要儀器：PCR儀、超速離心機、超級數顯恒溫器、透射電子顯微鏡、凝膠成像儀、恒溫細胞培養箱、恒溫搖床。

1.2 ORFV的PCR檢測

1.2.1 引物的設計與合成 參照GenBank公布的ORFV保護性抗原基因B2L(GenBank登錄號：HM466933.1)的序列，用Primer 5.0軟件設計1對特異性引物(表1)，引物由北京華大基因合成。

1.2.2 DNA的提取和B2L基因的PCR擴增 用總DNA提取試劑盒抽提病毒DNA，以其為模板用B2L基因引物進行PCR擴增，引物序列見表1。反應體系為:10×buffer(含MgCl2)2.0 μL，2.5 mmol/mL dNTP 0.6 μL，20 mmol/mL上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，TaqDNA 聚合酶(2.5 U/mL)0.5 mL，用DEPC處理過的雙蒸水補足體積至20 μL。反應條件為:95 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性50 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環； 最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產物于10 g/L瓊脂糖凝膠上進行電泳，觀察PCR擴增結果。

1.3 病毒分離

取1.1.1中的病料處理上清液1 mL接種于生長良好的Vero細胞，37 ℃吸附2 h，中間每隔20 min輕搖1次細胞瓶，吸附完成后棄去上清液，加入含體積分數2%胎牛血清的DMEM細胞維持液，于37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養箱靜置培養，每天觀察細胞病變效應(CPE)。如果在接種病料后4～5 d內細胞沒有出現CPE，連續盲傳3代，傳至第5代還未出現CPE，即可判定相應的ORFV病料為陰性。

1.4 病毒學鑒定

收集出現CPE的細胞培養物，反復凍融3次，3 000 r/min離心20 min，取含有病毒的上清液用2%磷鎢酸溶液(2 g磷鎢酸溶于100 mL雙蒸水)負染后用電鏡進行形態學觀察。用純化的病毒液劃痕接種于2月齡試驗羊唇部，每只接種0.5 mL，同時設對照組，對照組以同樣的方法接種無菌PBS 0.5 mL。接種后每天對接種部位進行病變觀察，進行動物回歸試驗。

1.5 ORFV 新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF及VEGF基因的擴增與克隆

參照GenBank公布的ORFV保護性抗原基因F1L(GenBank登錄號：AY040081.1)及毒力基因GIF(GenBank登錄號：DQ922634.1)、VIR(GenBank登錄號：AY386264.1)和VEGF(GenBank登錄號：AF106020.1)的序列，用Primer 5.0軟件分別設計合成4對特異性引物，引物序列見表1。以總DNA提取試劑盒抽提病毒基因組DNA為模板，進行PCR擴增，PCR反應體系同1.2.2，反應條件為:95 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性50 s，54～62 ℃(具體退火溫度以擴增基因而定，F1L、VIR、GIF、VEGF和B2L基因退火溫度分別為 62，55，59，54和60 ℃)退火35 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產物分別用DNA凝膠回收試劑盒回收，然后分別與pMD18-T載體連接，并轉化到DH5α感受態細胞中，擴菌培養后，通過菌液PCR進一步篩選驗證陽性克隆。每個基因挑取鑒定正確的克隆送北京華大基因公司測序。

1.6 ORFV 新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF及VEGF基因的測序與遺傳進化分析

分別從GenBank上下載已登錄的基因序列，應用DNAStar及MEGA 5.0軟件分別對獲得的3株ORFV新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF及VEGF5個基因的測序結果進行氨基酸同源性和遺傳進化樹分析。

2 結果與分析

2.1 ORFV B2L基因的PCR檢測

以從病料中提取的病毒基因組DNA為模板，用B2L基因的特異性引物進行PCR擴增，獲得長度約為1 137 bp的擴增片段(圖1)，與預期的DNA片段長度相符。

2.2 ORFV的分離

用Vero細胞從患病羔羊唇部痂皮中分離獲得了3株ORFV新疆流行株，分別命名為ORFV-SHZ1、ORFV-SHZ2和ORFV-SHZ3。ORFV-SHZ分離株接種前5代細胞上的CPE不太明顯，盲傳至第5代時細胞出現變圓、收縮和聚堆等現象(圖2)，隨著連續的傳代，細胞病變越來越明顯，可見細胞脫落的“拉網狀病變”。ORFV-SHZ1在Vero細胞上引起的細胞病變效應(CPE)見圖2。

2.3 ORFV的鑒定

通過電鏡觀察可見典型的痘病毒粒子，直徑達200 nm左右。病毒粒子外觀呈橢圓形、有囊膜，病毒粒子表面有繩索樣結構纏繞。ORFV-SHZ1株的電鏡負染觀察結果見圖3。用0.5 mL純化病毒液劃痕接種于2月齡試驗羊唇部，接種后1周在其口角和唇部等部位出現丘疹、膿皰，以后逐漸結痂愈合。接種ORFV-SHZ1的動物臨床癥狀見圖4。對照組未見任何病變。

2.4 ORFV 新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF 及 VEGF基因的克隆

以從細胞收毒液中提取的ORFV-SHZ分離株的病毒基因組DNA為模板，對B2L、F1L、GIF、VIR和VEGF基因進行PCR擴增，分別獲得長度約為1 137，1 023，798，552和402 bp的擴增片段，與預期的DNA片段長度相符。ORFV-SHZ1株B2L、F1L、GIF、VIR和VEGF基因的PCR擴增結果見圖5。測序結果顯示，以上擴增的5個基因均為目的基因。

2.5 ORFV 新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF及VEGF基因編碼氨基酸的同源性分析

分析結果表明，ORFV保護性抗原基因B2L、F1L相對保守，ORFVB2L和F1L基因編碼氨基酸序列與其他參考株的同源性分別為88.6%～97.9%和86.7%～97.4%；毒力基因VIR、GIF、VEGF的變異相對較大，尤其是VEGF基因。VIR、GIF和VEGF基因編碼氨基酸序列與其他參考株的同源性分別為91.8%～97.3%，85.2%～97.0%和71.5%～98.5%。ORFV-SHZ株VEGF基因氨基酸序列與ORFV-Ena、ORFV-GE、ORFV-HIS、ORFV-IJS081、ORFV-IT-C2、ORFV-IT-TO、ORFV-NA1-11、ORFV-NZ2、ORFV-Orf-119、ORFV-OVIA82、ORFV-Aichi和ORFV-D1701等12個參考株的氨基酸序列比對結果如圖6所示。

2.6 ORFV新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF及VEGF基因的遺傳進化分析

基于GIF基因的遺傳進化樹顯示，ORFV-SHZ分離株均與印度分離株(ORFV-MUK59-55)的親緣關系最近；基于VEGF的遺傳進化樹顯示，3株ORFV-SHZ分離株均與新西蘭分離株(ORFV-NZ2)的親緣關系最近 (圖7) ；基于B2L和VIR基因的遺傳進化樹分析表明，ORFV-SHZ1和ORFV-SHZ2 分離株均與臺灣分離株(ORFV-Nantou/ORFV-Hoping)的親緣關系最近(圖8和圖9)；F1L基因的遺傳進化樹顯示，分離的3株ORFV分布于2支，其中ORFV-SHZ1、ORFV-SHZ3分別與意大利分離株ORFV-OV Torino和ORFV-OV-C2聚為一支，ORFV-SHZ2與美國分離株(ORFV-OV-SAOO)的親緣關系較近，聚為一支(圖9和圖10)。

3 討 論

羊口瘡是一種重要的人畜共患傳染病，可引起人和動物發生傳染性接觸性皮炎，且傳播速度快，傳染范圍廣，對養羊業危害最為嚴重。近年來，該病在世界各地的發生呈不斷上升趨勢，ORFV感染的宿主范圍在逐漸擴大[7]。疫苗接種是預防和控制該病發生的有效手段。當前國內外主要使用常規的弱毒疫苗對該病進行免疫防治。這些疫苗能在一定程度上降低感染率，被證實是安全有效的。然而，近年來有研究報道弱毒疫苗免疫后，不能提供有效的保護[8]，推測ORFV流行株可能發生了遺傳變異。Oem等[9]分別在2009和2012年對韓國ORFV分離株ORF/09、ORF/2011株進行遺傳進化分析，結果顯示B2L和VIR基因存在著變異，并指出ORFV感染宿主有從奶山羊向黑山羊過渡的趨勢；Chan等[10]對臺灣ORFV分離株的研究結果表明，ORFV-A32L基因存在有較大變異；Li等[11]對ORFV-Nongan分離株NA1/11的遺傳進化研究結果顯示，ORFV110和ORFV132(VEGF)基因均發生了較大的變異。本試驗分別對ORFV分離株的2個保護性抗原基因和3個毒力基因進行了克隆、測序及遺傳進化分析，結果表明，ORFV新疆流行株存在著變異現象，尤其是毒力基因VEGF的變異最大，與GenBank上公布的其他參考株的VEGF編碼氨基酸序列的同源性為71.5%～98.5%?；贐2L和VIR基因的遺傳進化樹顯示，ORFV-SHZ1和ORFV-SHZ2與臺灣分離株(ORFV-Nantou/ORFV-Hoping)的親緣關系最近，因此推測ORFV新疆流行株可能是由臺灣株與其他毒株重組后產生的。

目前，在ORFV上已經發現的毒力基因主要有VIR、vIL-10、GIF和VEGF。這些基因都位于ORFV基因組2個末端的反向重復序列中，屬于ORFV基因組的易變區域[12]。研究發現，VIR基因編碼的干擾素抑制蛋白，能抑制干擾素，在病毒感染早期發揮重要作用；vIL-10編碼蛋白可誘發不同細胞產生免疫刺激或免疫抑制作用，是一種重要的免疫調節因子，具有抑制炎癥介質產生、T細胞活化增殖及降低抗原遞呈等作用，在病毒的免疫逃避機制中發揮著重要作用；VEGF編碼的血管內皮生長因子在病毒感染的宿主中能引起血管內皮強烈增生和血管高度擴張[13]。GIF是一種特異性的雙重細胞因子結合蛋白，能夠與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素-2(IL-2)結合，并抑制二者活性，且僅有副痘病毒屬成員才具有編碼GIF基因序列的功能[14]。到目前為止，對ORFV毒力基因遺傳變異的研究報道還較少，尚不清楚這些毒力基因變異對其致病力的影響。因此，開展ORFV主要保護性抗原基因和毒力基因及其編碼蛋白的研究，不僅有助于闡明ORFV遺傳變異的規律和致病分子機理，而且可為該病的科學防控提供理論依據。

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Isolation,identification and phylogenetic analysis of Orf virus epidemic strains in Xinjiang

YANG Hai-bo1,MENG Qing-ling1,QIAO Jun1,CAI Xue-peng2,HE Zhi-hao1, LIU Yu-cheng1,PENG Ye-long1,WANG Guo-chao1,CHEN Chuang-fu1,NUERKANJIE Du-man3

(1KeyLaboratoryofPreventionandcontrolofAnimalDisease,DepartmentofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832003,China;2LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou,Gansu730046,China;3AnimalHusbandryandVeterinaryStation,Shawan,Xinjiang832100,China)

【Objective】 This study aimed to investigate the genetic evolution situation of Orf virus (ORFV) epidemic strains in Xinjiang.【Method】 Samples were collected from lamb with suspected ORFV infection in Shihezi region,and the strains were identified by PCR amplification,isolation and culture in Vero cell,electron microscopy,and animal regression.The major protective antigen genesB2LandF1Land virulence genesVIR,GIFandVEGFof the three identified ORFV were cloned,sequenced,and phylogenetically analyzed.【Result】 Three ORFV isolates(ORFV-SHZ1,ORFV-SHZ2,and ORFV-SHZ3) were isolated and identified from collected samples.ORFV protective antigen genesB2LandF1Lwere relatively conservative,sharing 88.6%-97.9% and 86.7%-97.4% identities in amino acid sequence with other reference strains.The virulence gene variation was significant,especially forVEGFgene.Amino acid identities ofVIR,GIFandVEGFgenes with other reference strains were 91.8%-97.3%,85.2%-97.0%,and 71.5%-98.5%,respectively.Phylogenetic tree analysis based onB2LandVIRgenes showed that ORFV-SHZ1 and ORFV-SHZ2 strains were close to isolates from Taiwan.【Conclusion】 Recombination occurred among Shihezi isolates,Taiwan strains and other strains, causing great variation in virulence genes.

Orf virus;isolation and identification;phylogenetic analysis;Xinjiang

2013-09-29

兵團國際科技合作計劃項目(2012BC006)；國家農業公益行業專項子課題(201303037-5)

楊海波(1988-)，男，河南舞陽人，碩士，主要從事病原分子生物學研究。E-mail:yhb1988043@126.com

喬 軍(1971-)，男，陜西榆林人，教授，博士，主要從事分子病毒學研究。E-mail:qj710625@163.com

時間:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.001

S852.65+4

A

1671-9387(2015)02-0014-09

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.001.html