苯二酚內酯合成途徑中的聚酮合酶組合表達研究

白 凈, 陸 偉, 徐玉泉, 陳 明

中國農業科學院生物技術研究所, 北京 100081

研究論文

苯二酚內酯合成途徑中的聚酮合酶組合表達研究

白 凈, 陸 偉, 徐玉泉, 陳 明*

中國農業科學院生物技術研究所, 北京 100081

由真菌聚酮合酶合成的苯二酚內酯類次生代謝產物結構和功能多樣，在醫藥和農業上具有廣泛的用途。苯二酚內酯由一對還原型聚酮合酶和非還原型聚酮合酶協同生物催化合成。還原型聚酮合酶和非還原型聚酮合酶由多功能結構域組成，每個結構域在生物合成的過程中程序化地執行特定的功能。通過交換不同真菌苯二酚內酯合成途徑中非還原型聚酮合酶的起始物?；D移酶結構域，在釀酒酵母中與相應的還原型聚酮合酶組合表達，合成了“非天然”的苯二酚內酯聚酮產物，并初步討論了起始物?；D移酶結構域的識別規律。

聚酮合酶;真菌;苯二酚內酯;生物合成

真菌苯二酚內酯聚酮化合物是一類結構和生物活性多樣的次級代謝產物，對真菌自身生長、發育等產生重要影響。該類化合物在醫藥和農業生產中具有廣泛的應用，例如，脫氫彎孢霉素(dehydrocurvularin)具有免疫抑制劑的活性[1]，根赤殼菌素(radicicol)能夠抑制Hsp90分子伴侶蛋白的合成，具有抗腫瘤的活性[2]。

大多數真菌聚酮類化合物是由多結構域的聚酮合酶(polyketide synthase，PKSs)通過克萊森(Claisen)縮合反應將小分子羧基酸單體催化合成長鏈化合物。聚酮合酶的催化結構域共價相連,其中的3個基本功能結構域分別為：酮縮酶結構域(KS)、?；D移酶結構域(AT)和?；d體蛋白結構域(ACP)[3]。2001年，Nicholson等[4,5]根據基因中編碼的結構域將真菌PKSs進一步分為3種不同類型：不能還原β酮基的非還原型聚酮合酶(non-reduced PKS，NR PKS)，部分還原型聚酮合酶(parcially reduced PKS，PR PKS)和完全還原型聚酮合酶(highly reduced PKS，HR PKS)。非還原型聚酮合酶含有起始物?；D移酶結構域(SAT)、產物模板結構域(PT)和硫酯酶結構域(TE)。在某些情況下，還包含轉甲基酶結構域(CM)和還原酶結構域(R)。部分或完全還原β酮基的還原型聚酮合酶，不含有SAT、PT、TE結構域，但含有β酮脂酰還原酶結構域(KR)、脫水酶結構域(DH)和烯酰還原酶結構域(ER)。

近幾年對真菌聚酮合酶各個結構域功能的研究為天然聚酮類化合物的程序化合成機制奠定了重要理論基礎。研究發現KS結構域控制了最終聚酮化合物的鏈長，并不是延伸次數。KS結構域與產物甲基化也有著一定的關系[6]。丙二酰AT結構域在轉移丙二酰輔酶A基團時對底物有特異性[7]。硫酯酶結構域(TE)不僅影響聚酮產物的結構，而且還影響聚酮產物的產量[8]，并決定了產物最后的釋放。PT結構域在聚酮化合物的產生中是必不可少的，并且它控制了產物的F和S環化模式[6，9]。PT結構域通過特定醛的環化和芳構化將可變的前體轉變為穩定的形式，因而增強了產物的穩定性[10]。最近對PksA PT結構域單體的晶體學研究表明PT催化活性中心由3部分構成：入口端的磷酸泛酰巰基乙胺(PPT)結合區域、催化口袋底端的疏水乙基結合結構域和兩者之間的環化腔。從而在結構上解釋了分子環化的機制。SAT結構域特異地選擇起始單元，通過轉移起始單元到ACP結構域來起始聚酮化合物的合成[11]。

利用基因敲除和異源表達等方法，已證明真菌苯二酚內酯聚酮代謝物的生物合成是由一對還原型和非還原型的聚酮合酶共同催化完成。還原型聚酮合酶合成聚酮鏈(最終形成苯二酚內酯的大環部分)作為起始單元被轉移到非還原型聚酮合酶上，通過非還原型聚酮合酶得到延伸，延伸的聚酮鏈部分不再被進一步還原。隨后，非還原型聚酮合酶逐步催化形成苯二酚環和大環內酯環。在苯二酚內酯中，二羥基苯甲酸內酯(RALs)在C2～C7形成苯環，而二羥基苯乙酸內酯(DALs)則在C3～C8形成苯環[12]。天然RALs內酯環一般為12或14環(RAL12或RAL14)，例如Monocillin Ⅱ。而DALs內酯環為10或12環(DAL10或DAL12)。但對于聚酮鏈是如何起始、延長、折疊以及環化仍有待進一步研究。

通過將不同真菌來源的還原型聚酮合酶和非還原型聚酮合酶隨機重組能夠實現一系列“非天然”苯二酚內酯類聚酮產物的一步合成[3]。本研究將通過交換不同真菌苯二酚內酯合成途徑中非還原型聚酮合酶的起始物?；D移酶結構域(SAT)，并在酵母中與相應的還原型聚酮合酶組合表達，以期合成新的聚酮化合物和發現起始物?；D移酶結構域的識別規律。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體

高頻轉化大腸桿菌DH10B和釀酒酵母BJ5464為本實驗室保存。大腸桿菌-釀酒酵母兼容性表達載體YEpADH2-Trp-FLAGLink和YEpADH2-Ura-FLAGLink為本實驗室保存。pJET1.2/blunt高拷貝克隆質粒購買于Fermentas公司，具有Amp抗性。

1.2 培養基及培養條件

LB培養基：酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、胰蛋白胨10 g/L，固體培養基配制時加入瓊脂15 g/L。

YPD培養基：酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、D-葡萄糖20 g/L。

SC二缺培養基：不含氨基酸的酵母基本氮源6.7 g/L，Trp-Ura缺失氨基酸混合物0.72 g/L，D-葡萄糖20 g/L。固體培養基配制時加入瓊脂20 g/L。

大腸桿菌在LB培養基中37℃培養。釀酒酵母在YPD培養基30℃培養。酵母發酵使用含1%葡萄糖的YPD培養基；酵母篩選選用合成缺陷型培養基SC基本培養基(Trp-Ura二缺培養基)。

1.3 主要試劑與儀器

DNA聚合酶Phusion Hot Start ⅡHigh-Fidelity DNA Polymerase Kit購自Finnzymes公司；質粒提取試劑盒EZ-10 Spin Column plasmid DNA miniPreps Kit購自BIO BASIC INC. 公司；DNA膠回收試劑盒GeneJETTM Gel Extraction Kit、DNA連接試劑盒CloneJETTM PCR Cloning Kit購自Thermo公司，限制性內切酶購于NEB公司和Thermo公司。酵母感受態細胞制備及酵母轉化試劑盒Frozen EZ Yeast Transformation Ⅱ(TZ001) 購自ZYMO RESEARCH公司。引物由Bioneer公司合成。高壓液相色譜儀(Hp Hewlett-Packard Series 1050)為Agilent/Hewlett-Packard公司產品。

1.4 基因克隆

以Genbank中已注釋信息的真菌聚酮合酶基因為參照，利用生物信息學軟件FGENESH和手工相結合的方法預測選定基因的內含子和外顯子區域。每個基因都被設計為翻譯起始位點含有NdeⅠ(或AseⅠ)酶切位點，終止子后含有PmeⅠ酶切位點，利用融合PCR的方法將預測的外顯子組裝在一起合成完整的無內含子的基因。融合PCR擴增程序為：98℃預變性30 s；98℃變性10 s，62℃退火20 s，72℃延伸，延伸時間依產物而定，2 kb/min，30個循環；72℃延伸10 min。

1.5 酵母表達載體構建

YEpADH2-Trp-FLAGLink和YEpADH2-Ura-FLAGLink為兼容性釀酒酵母表達載體，其啟動子為乙醇脫氫酶誘導啟動子，可以起始真菌聚酮合酶基因的表達。將獲得的選定基因連接到pJET1.2/blunt大腸桿菌高拷貝克隆質粒上，測序正確后，使用NdeⅠ(或AseⅠ)和PmeⅠ雙酶切pJET1.2/blunt質粒及釀酒酵母表達載體，將切膠回收的非還原型聚酮合酶基因片段與YEpADH2-Trp-FLAGLink使用T4 DNA連接酶連接，還原型聚酮合酶基因片段與YEpADH2-Ura-FLAGLink載體連接。經酶切驗證連接正確后用于釀酒酵母的轉化。

1.6 SAT結構域的交換

通過融合PCR的方法，將乙醇脫氫酶誘導型啟動子ADH2p和終止子ADH2t分別克隆到pXW06和pXK30F上，還原型聚酮合酶基因和非還原型聚酮合酶基因的載體分別命名為pXK30F-nr PKS和pXW06-Red PKS。在實驗室已成功構建好的聚酮化合物10，11-dehydrocurvularin和resorcylide 非還原型聚酮合酶AtCurS2和AzResS2表達質粒的基礎上，通過融合PCR的方法將asperfuranone非還原型聚酮合酶AfoE與AtCurS2和AzResS2的SAT結構域進行交換。融合PCR擴增程序見1.2.1。

1.7 酵母轉化

使用Frozen EZ Yeast Transformation Ⅱ(TZ001)試劑盒將構建的載體轉入到釀酒酵母中，該酵母的染色體上整合有構巢曲霉磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶，使其表達的聚酮合酶具有活性。在Trp和Ura二缺SC培養基上篩選雙質粒酵母轉化菌落。

1.8 發酵及產物萃取

分別挑取Trp和Ura二缺SC培養基平板上的2個菌落，接種到SC二缺液體培養基中至OD600nm=0.8，加入等體積的酵母豐富培養基1%葡萄糖的YPD，發酵72 h，調節菌液的pH至5.0，用等體積的乙酸乙酯萃取發酵產物，真空低溫蒸餾，用少量的甲醇溶解，14 000 r/min離心10 min，取20 μL用于HPLC分析。

1.9 產物鑒定

采用高效液相色譜法(HPLC)測定發酵產物。采用Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm，SUPELCO Inc.)。HPLC條件為：采用水(0.1%TFA)/乙腈(0.1%TFA)為流動相。0 min：水-乙腈(95∶5)；5 min：水-乙腈(95∶5)；15 min：水-乙腈(5∶95)；20 min：水-乙腈(5∶95)；25 min：水-乙腈(95∶5)。柱溫為室溫；進樣量為15 μL；檢測波長300 nm；流速0.8 mL/min。

2 結果與分析

2.1 真菌苯二酚內酯聚酮合酶相似性分析

真菌苯二酚內酯由一對多功能結構域組成的模塊化還原型聚酮合酶(HR PKS)和非還原型聚酮合酶 (NR PKS)協同催化合成。在組成上還原型聚酮合酶各結構域的排列方式為KS-AT-DH-KR-ER-ACP，非還原型聚酮合酶各結構域的排列方式為SAT-KS-AT-PT-ACP-TE(圖1)。不同真菌的HR PKS和NR PKS具有較高的直向同源關系。以合成苯二酚內酯radicicol、dehydro-curvularin、lasiodiplodin和resorcylide的聚酮合酶為例，還原型聚酮合酶氨基酸的一致性為54%～59%，非還原型聚酮合酶氨基酸的一致性為60%～68%。

圖1 苯二酚內酯聚酮合酶的結構Fig.1 The structure of fungal benzenediol lactones polyketide synthase.

在構巢曲霉Aspergillusnidulans中，聚酮asperfuranone和苯二酚內酯具有相似的生物合成途徑，其核心骨架由還原型聚酮合酶AfoG和非還原型聚酮合酶AfoE協同合成。 AfoE由8 285個氨基酸組成，疏水性氨基酸占20.64%。將AfoE與參與合成上述苯二酚內酯的4個非還原型聚酮合酶(CcRadS2、AtCurS2、LtLasS2、AzResS2)進行序列比對。結果表明：AfoE與上述4種苯二酚內酯非還原型聚酮合酶的序列相似性為50%～51%，其他4個聚酮合酶之間的序列相似性都達到60%以上(表1)。AfoE與上述四種苯二酚內酯聚酮合酶的差異，有可能通過合成途徑或結構域的重組合成新的聚酮化合物。

2.2 AfoE SAT結構域的互換研究

在苯二酚內酯聚酮的生物合成中，利用不同來源的還原型聚酮合酶和非還原型的聚酮合酶重組，或者替換非還原型聚酮合酶的起始物?；D移酶結構域SAT可合成“非天然”的聚酮化合物。

本研究采取了體外克隆絲狀真菌構巢曲霉asperfuranone非還原型聚酮合酶afoE基因，并對AfoE的SAT結構域與10，11-dehydrocurvularin和resorcylide 非還原型聚酮合酶AtCurS2和AzResS2的SAT結構域在體外進行了交換，形成了新的雜合非還原型聚酮合酶AfoE-SATAtCurS2、AfoE-SATAzResS2、AtCurS2-SATAfoE和AzResS2-SATAfoE。通過重組酵母，分離發酵產物，發現土曲霉AtCurS2及AzResS2的SAT結構域不能識別asperfuranone還原型聚酮合酶AfoG合成的產物，因此沒有新的產物合成。而構巢曲霉非還原型聚酮合酶的SAT結構域卻可以識別10，11-dehydrocurvularin和resorcylide還原型聚酮合酶AtCurS1和AzResS1合成的產物，異源合成新的化合物1～5(圖2)。

表1 真菌苯二酚內酯聚酮合酶相似性分析Table 1 Similarity analysis of fungal benzenediol lactones polyketide synthase.

圖2 重組發酵代謝產物變化Fig.2 Biosynthetic products of S.cerevisiae BJ5464-NpgA coexpressing nrPKS and hrPKS.

這些產物具有苯二酚內酯類聚酮典型的紫外吸收光譜。以上結果表明，除了SAT結構域，非還原型聚酮合酶的其他結構域也對還原型聚酮合酶的產物有選擇利用的能力。鑒于真菌聚酮合酶基因的多結構域的復雜特性，對于其程序化合成機制仍需進一步研究。

3 討論

在基因組中，合成苯二酚內酯的聚酮合酶HR PKS和NR PKS 編碼基因位于同一基因簇上。在構巢曲霉中，有一對符合苯二酚內酯聚酮合酶特征的基因，非還原型聚酮合酶基因afoE及還原型聚酮合酶基因afoG，但在不同的培養條件下均分離不到聚酮類次生代謝產物，將afoE缺失突變，代謝譜也沒有變化，說明這對基因在培養條件下是沉默的。將這對基因上游轉錄因子的啟動子更換為可誘導的乙醇脫氫酶啟動子alcA(P)后，在誘導條件下可以激活整個基因簇的表達，而且能夠檢測到新的聚酮類化合物，命名為asperfuranone[9]，結構鑒定表明其結構中含有一個高度還原的側鏈[7]。本實驗進一步證明更換基因啟動子可以用于激活沉默基因的表達，并且體外構建表達質?？梢钥s短產物生產周期，用于大量次級代謝產物的組合生物合成中。

非還原型聚酮合酶SAT結構域特異識別底物，開啟鏈的延伸。研究表明SAT結構域可以識別與天然底物不同的起始單元。Xu等[1]通過交換不同真菌苯二酚內酯非還原型聚酮合酶的SAT結構域，能夠產生新的聚酮化合物或提高產物的產量。Wang等[2]也使用相同策略通過交換絲狀真菌構巢曲霉非還原型聚酮合酶AfoE(asperfuranone biosynthesis)和雜色曲霉素聚酮合酶(sterigmatocystin biosynthesis，StcA)的SAT結構域得到一個StcA-AfoE雜合聚酮合酶，能夠催化產生一種新的主要次級代謝產物。產物結構鑒定表明非還原型聚酮合酶(NR-PKSs)的SAT結構域可以識別長度與天然底物不同的起始單元。本研究中，土曲霉AtCurS2及AzResS2的SAT結構域不能識別asperfuranone還原型聚酮合酶AfoG合成的產物，這可能是由于起始單元太短，不能識別新的SAT結構域，因此不能產生代謝產物，或者是由于這些次級代謝產物雖然能夠產生，但由于產量太低，不易檢測到。另一種可能是結構域之間不兼容，因而形成的嵌合體沒有活性。同時在構巢曲霉中，聚酮化合物中間體的甲基化作用也會影響分子的空間結構。具體原因仍需進一步實驗驗證。通過苯二酚內酯基因的人工合成、異源表達以及結構域的交換為人工合成“非天然”次級代謝產物提供了一種新的方法。這種“即插即用”模塊化方法可應用于結構多樣的全新化學物質的組合生物合成，為揭示天然聚酮類化合物的合成機制奠定了重要的理論基礎。本研究對進一步開發新型聚酮類生物活性物質、預測真菌聚酮合酶基因的功能和提高真菌基因組注釋精度具有重要的參考價值。

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Combinatorial Biosynthesis of Benzenediol Lactones with Domain Swaps

BAI Jing, LU Wei, XU Yu-quan, CHEN Ming*

BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China

Fungal benzenediol lactones, biosynthesized by a pair of highly reduced polyketide synthases and non-reduced polyketide synthases, have diverse structures and varied biological activities. Fungal polyketide synthases contain multiple functional domains which catalyze the specific structure of final products. We found that unnatural polyketides could be synthesized in the yeastSaccharomycescerevisiaeco-expressing different reduced fungal polyketide synthases and non-reduced polyketide synthases with functional domain swaps. Furthermore, identification pattern of acyltransferase domain was studied and discussed.

polyketide synthases; fungi; benzenediol lactones; biosynthesis

2014-12-16; 接受日期：2014-12-30

轉基因生物新品種培育科技重大專項(2014ZX08003-001)；國家863計劃項目(2012AA02A703)；農業部公益性行業科研專項(201103007)資助。

白凈，碩士研究生，主要從事次生代謝產物的組合生物合成研究。E-mail：baijing19901028@163.com。*通信作者：陳明，研究員，博士，主要分子微生物生物學研究。E-mail：chenming01@caas.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.01.08