BOD 微生物傳感器關鍵技術及其發展*

李一錦，夏善紅

(1.中國科學院 電子學研究所 傳感技術國家重點實驗室，北京100190;2.中國科學院大學，北京100049)

0 引 言

近年來，隨著工業廢水、生活污水等的大量排放，水污染情況日益嚴重。我國制定了GB 3838—2002《地表水環境質量標準》，將水質分為5 類。水質分類指標主要包括化學需氧量(COD)、五日生化需氧量(BOD5)、氨氮、總磷、總氮等。其中，生化需氧量(BOD)是指在規定條件下，微生物分解水中某些可氧化物質，特別是有機物所進行的生物化學過程中所消耗的溶解氧的量［1］。BOD 是表征水中有機物含量的一項重要指標，其值越大，水中有機污染物含量越多，污染越嚴重。我國規定的標準檢測方法為BOD5，即水樣充滿完全密閉的溶解氧瓶中，在(20±1)℃的暗處培養5 d±4 h 或(2+5)d±4 h，分別測定培養前后水樣中溶解氧的量，由2 次測量的差值計算每升樣品消耗的溶解氧。該方法存在測定精度低、重現性差、耗時長及操作繁瑣等缺點，不適于BOD 的快速在線監測。測壓法［2］、檢壓庫侖法操作過程簡便，但不能縮短培養周期;活性污泥曝氣法準確度高，分析過程簡便，但由于曝氣過程中培養瓶內的空氣流量不易控制，不具有普遍適用性。

1977 年，Karube I 等人［3］首次提出將從土壤中分離出來的微生物固定在膠原蛋白膜上，并與氧電極組成微生物傳感器，檢測廢水BOD。該方法實現了BOD 的快速測定(1 h 以內)，簡化了操作步驟，但其輸出信號僅能在10 d 內保持穩定。此后，很多科學工作者對BOD 快速測定進行了研究［4～10］。

本文闡述了BOD 微生物傳感器制備中選取微生物、固定微生物和選取換能器等關鍵技術，分析了不同方法的特點;分別對構成BOD 檢測系統的各個部分進行了總結;討論了目前BOD 微生物傳感器研究中存在的問題，并對其研究發展趨勢進行展望。

1 BOD 微生物傳感關鍵技術

BOD 微生物傳感器一般由兩部分組成:生物識別元件和轉換元件。生物識別元件是利用微生物的生化反應對待測底物進行識別響應的部分，一般分為微生物的選取和培養以及微生物固定兩個步驟。轉換元件是將生物響應信號轉換成可測電信號、光信號等的部分。

1.1 微生物的選取和培養

BOD 微生物傳感器中，所選微生物需要具有廣譜性(即對待測底物的低選擇性)、穩定性、無毒和對環境的耐受性等。一般作為生物識別元件的微生物可以是單一菌種、菌群、死細胞或酶等。

單一菌種作生物識別元件的微生物傳感器具有長期穩定性好、信號重現性好等優點，但由于其代謝能力有限，一般只能檢測特定類型的廢水。常用于單一菌種檢測的微生物包括皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum)［4］，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［5］，大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)［6］，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)［7，8］等。Arlyapov V 等人［9，10］發現C.maltosa，C.blankii，和D.hansenii 三種微生物均具有對水中有機物的氧化能力。其中，D.hansenii對實驗中的34 種有機物均具有較好的降解能力，利用其制備的BOD 傳感器檢測范圍可達0.7 ～207 mg/L。

由菌群構成的微生物傳感器一般廣譜性好，能實現多種有機物的快速降解，但由于多種微生物之間存在競爭或捕食關系，傳感器的穩定性和重現性較差。Kumlanghan A等人［11］利用從橡膠工業廢水中分離出的活性污泥作為生物識別元件制備BOD 微生物傳感器，可實現橡膠工業廢水的在線和離線檢測，線性范圍5 ～60 mg/L，可穩定測量15 d(每日測量3 次)，穩定性標準偏差±8.3%。為了利用菌群的廣譜性，同時保持系統的穩定性，研究人員利用流動注射系統進行檢測。Liu Jing 等人［11］選用菌群作為生物識別元件實現BOD 在線監測，檢測線性范圍為5 ～700 mg/L。通過注射新的菌糊進行微生物的更新而不用分解傳感器系統，微生物可日更新，更新后24 h 內傳感器響應的標準偏差僅為±2.4%。

死細胞作為生物識別元件，可批量加工、長期儲存，其酶系統受細胞壁的保護而免于失活或中毒，盡管已失去自修復和再生能力，其也能保持良好的活性和穩定性。Tan T C 等人［13］應用加熱到280 ℃并真空干燥2.5 min 得到的B.subtilis 死細胞制備的BOD 微生物傳感器，其線性范圍和重復性等均與固定活體微生物的結果類似。相比之下，雖然該傳感器的靈敏度較低，恢復時間較長，但其穩定性可維持140 d(含400 次測量)。Kim Mal Nam 等人［14］利用酶和微生物共同作為生物識別元件，固定Klebsiella sp.后，再固定相應的多糖酶，從而提高傳感器對相應多糖的響應和BOD的檢測靈敏度。選定菌種后，還需選擇合適的生長時期。一般的，微生物的生長時期分為遲滯期、對數生長期、穩定期和衰亡期。處于對數生長期的微生物量很大且具有較高的細胞活性，適宜作為生物識別元件。李洛娜等人［5］選擇對數生長末期的枯草芽孢桿菌進行固定，制成微生物膜，進行BOD 檢測。該傳感器的響應時間僅為8 min。

1.2 微生物固定化

微生物固定具有熱穩性較高，可重復使用和反應后無需與反應物分離等優點，且有研究發現，固定微生物制備的傳感器具有更寬的線性范圍［15］，故一般傳感器制備過程中需要固定微生物。固定材料和方法影響著傳感器的靈敏度、響應時間和使用壽命等。目前，微生物固定方法主要有吸附法、包埋法、夾層法和交聯法等。

吸附法是利用載體之間的靜電相互作用進行細胞固定，可分為物理吸附和離子吸附。吸附法操作簡單，對微生物無毒害作用，細胞活性損失小，但長時間使用后菌種易脫落，影響使用壽命。Dhall P 等人［16］運用吸附法將增效的菌群固定在尼龍膜(孔徑為0.45 μm)上制成微生物膜，固定于氧電極上構成BOD 傳感器。該傳感器響應時間為90 min，可以在400 d 內、間斷測量條件下保持穩定性和活性。

包埋法是最常用的方法，它是將細胞裹于凝膠的微小格子內或半透膜聚合物的超濾膜內。包埋法制備的微生物膜機械強度雖有提高，微生物活性也較交聯法高，但該方法不適用于涉及大分子物質的反應，故在實際檢測中需對水樣進行預處理。Liu Ling 等人［17］利用共焦激光掃描顯微鏡(CLSM)技術研究固定在有機無機復合材料上菌種的變形，進而研究其長期穩定性機理。研究結果表明，T.cutaneum 2.570 細胞包埋于硅和PVA－g－P(4－VP)的混合物中，其儲存時以節分生孢子狀態存在，這些休眠狀態的細胞能抵抗環境壓力，并能在適當的條件下被激活。Wang Jianlong 等人［18］將活性污泥包埋于聚乙烯醇(PVA)中形成珠狀顆粒置于特制的籠子中，籠子連接到小型升降機上，制成反應器式BOD 傳感器。該固定方法使得溶解氧和有機物的傳質阻力明顯降低，有效提高了BOD 檢測的靈敏度，并能夠保持生物活性70 d(每天測量8 次)。

夾膜法制備的微生物膜，使用壽命延長，菌體不易流失，操作簡單，無需任何化學處理，重現性較好，尤其適用于微生物和組織膜的制作，但其所需活化時間較長，制備中存在菌種定量問題。

交聯法是化學固定方法，采用非水溶性載體，如戊二醛、偶聯苯胺和牛血清白蛋白等。Yang Zhen 等人［4］將含有T.cutaneum 的混合溶液(含光致交聯的聚酰亞胺)澆鑄在氧電極陰極，然后在N2環境中紫外曝光3 min，制備好的BOD 傳感器置于磷酸緩沖液中。該法制備的微生物膜使用壽命提高，但固定微生物的成活率較低，制備過程較復雜，交聯劑用量和微生物量相互制約。

此外，微生物也可通過制備一定的反應器結構進行固定。Liu Changyu 等人［19］用HF/NH4F 溶液沖洗螺旋玻璃管內壁得到粗糙內表面。在優化的流速和溫度下向管內通入活性污泥培養液，通過溶解氧探針測量注射校準溶液后的電流響應來檢驗生物膜形成情況，當電流下降到一個穩定值時，穩定的生物膜形成。

1.3 換能器

BOD 微生物傳感器根據其換能器的不同可大致分為電化學型和光學型。電化學型BOD 傳感器又可分為氧電極型、媒介體型和微生物燃料電池型等。

1.3.1 氧電極型

氧電極型BOD 微生物傳感器最為普遍，是在電極表面覆蓋氧滲透膜和微生物膜，通過測量添加樣品前后溶液中溶解氧濃度變化檢測BOD。研究人員在工作電極選擇、電極表面修飾以及氧滲透膜的制備等方面都進行了廣泛的研究。

Ivandini T A 等人［20］研制了一種具有高穩定性的修飾金納米顆粒的摻硼金剛石電極，用于測定水中溶解氧，進而測定BOD。金納米顆粒催化O2的還原反應，其與摻硼金剛石之間的共價鍵提高了表面修飾的穩定性，從而提高了傳感器的穩定性，其電流響應的相對標準偏差僅為0.9%。Pang Heileung 等人［21］將TMOS，DiMe－DMOS，0.1 mol/L HCl和去離子水以1∶2.15∶1.7∶1.1 的體積比混合制備硅溶膠。該硅溶膠在25 ℃水浴中攪拌3.5 h 后以7 500 rpm 離心4 min。收集離心管底部的凝膠部分(1 mL)并將其與［Ru(dpp)3］Cl2(250 μL)溶液混合。32 μL 混合液置于每個微滴定板孔內，室溫暗處保存6 d 以制備一種高吞吐量的氧敏感膜。該膜中心厚度小于10 μm，均一無裂縫，具有很好的穩定性，可與聚苯乙烯微滴定板緊密黏附，且由于其疏水性可防止溶于水的離子或化合物的干擾，進而實現樣品中溶解氧的測定。

1.3.2 媒介體型

媒介體型BOD 微生物傳感器是以可逆氧化還原物，如鐵氰化鉀、二茂洛鐵等，替代溶解氧促進有機物發生生化反應，實現電子轉移，通過測量電極表面媒介體發生氧化反應的電子轉移數實現BOD 的檢測。該方法有兩個顯著優點:媒介體具有極強的氧化還原性能，可提高反應速率，減少反應時間;媒介體具有很高的溶解性，使輸出信號較大，檢測范圍較寬，有效克服了由于O2在水中的低溶解度帶來的響應信號弱和樣品需大量稀釋的問題。

Bonetto M C 等人［22］研究發現，選用K.pneumoniae 并利用鐵氰化物進行BOD 快速檢測時，樣品中的溶解氧對測定結果無影響，故無需對樣品進行除氧預處理，用GGA 溶液和OECD 溶液標定時其線性范圍分別為30 ～500mg/L 和30 ～200mg/L。Oota S 等人［23］將鐵氰化物溶于磷酸載體溶液，制備流動注射微生物反應器式BOD 傳感器。由于每次僅注射少量樣品溶液，系統的操作穩定性較高。媒介體不僅可以溶于載體溶液，也可以被固定成膜參與反應。Liu Ling 等人［24］將E.coli 和中性紅(neutral red，NR)媒介體混合固定成膜置于玻碳電極上，由于中性紅的強電子傳輸特性和膜的滲透性，制備的傳感器較分別固定兩層膜具有更強的響應信號。對于某些微生物，僅使用一種媒介體不能進行測試，需要采用雙媒介體系統。Nakamura H 等人［8］研究發現，真核生物S.cerevisiae 只有在鐵氰化物和甲萘醌共同存在時才能進行響應。分析認為甲萘醌可以滲入菌種外壁，產生甲萘醌基團，與鐵氰化物共同作用實現電子傳遞。

1.3.3 微生物燃料電池型

微生物燃料電池型BOD 傳感器是以微生物為催化劑，將有機物中的化學能轉換為電能的裝置［25］。電池轉化率一定，其產生的電荷量與底物質量濃度呈正比。典型微生物燃料電池由陽極室和陰極室構成，2 個極室由質子交換膜隔開，陽極室保持厭氧環境而陰極室保持好氧環境，陰陽兩極通過外電路連接。陽極室中，微生物催化分解有機物并釋放電子和質子，電子傳遞至陽極，后經外電路傳遞至陰極，質子經質子交換膜傳遞至陰極，并與來自外電路的電子和陽極室的O2反應生成水。微生物燃料電池型BOD 傳感器響應時間短，適用范圍廣，穩定性好且操作簡單，但質子交換膜的成本較高。吳鋒等人［26］研制了一種單室微生物燃料電池型BOD 傳感器。以MnO2代替金屬鉑作陰極催化劑，以陽離子交換膜代替昂貴的質子交換膜，對實際水樣進行檢測。傳感器線性范圍為5 ～50 mg/L，與BOD5的相對誤差在4.0%以內。

1.3.4 光學型

光學型BOD 傳感器是利用光源發出的光經過不同濃度樣品時，會引起光強、頻率、相位、偏振態等光學參數的變化，通過檢測這些參數的變化獲得待測樣品信息。光學型BOD 傳感器具有實時、快速、響應不受樣品流速影響等特點，但傳感器靈敏度、穩定性和使用壽命等方面還不能滿足現場監測的需求。

Sakaguchi T 等人［6］將從Vibrio fischeri 中提取的發光基因(lux A－E)植入E.coli，制成BOD 熒光傳感器。樣品中有機物含量不同時，微生物的發光強度不同，其檢測范圍為(3～200)×10－6。除利用微生物自身發光，也可通過加入發光物質進行檢測。Nakamura H 等人［7］利用S.cerevisiae與甲萘醌和溶解的有機物之間的還原反應產生過氧化氫和過氧根離子，這些產物在鐵氰化物的催化作用下與發光氨反應并產生430 nm 的化學發光，發光強度隨有機物濃度的增加而增強，實驗上證明了該方法用于BOD 檢測的可行性。Nakamura H 等人也實驗了一種通過測定吸光值檢測BOD 的方法［27］，即選擇2，6－二氯酚吲哚酚鈉(DCIP)作為還原顏色指示劑，微生物降解有機物，通過檢測DCIP 吸光值的減少量即可得到BOD 值。Zheng Ruijuan 等人［28］用CdS 修飾碳電極，加陰極脈沖電壓使電極表面發生熱電子引發的陰極電化學發光，光強隨樣品中溶解氧濃度的增大而增強，檢測線性范圍為1.7 ～33 mg/L，9 次平行檢測(8 mg/L溶解氧)的相對標準偏差為1.56%。該方法用于BOD 中溶解氧檢測，價格便宜，易于制造，穩定性和重復性較好。

1.3.5 其它類型傳感器

Zhang Jinzhong 等人［29］研制了一種通過測定壓電系統頻率改變量檢測BOD 的傳感器。微生物將有機物分解為無機或有機小分子，使樣品電導率發生變化，電極輸出連接晶振，測晶振的頻率改變量以測定BOD。該方法無需固定細菌，操作簡單方便。

2 BOD 微生物傳感系統

BOD 微生物傳感系統需要完成從采樣到得到準確BOD 結果的全過程。除研究構成傳感器的關鍵技術外，也需要進行預處理水樣，選取標準溶液，優化測試條件和選擇測定方法等環節。

2.1 水樣預處理

采集到的水樣一般不能直接進行檢測，若樣品BOD 超出檢測范圍，需進行稀釋。Dhall P 等人［16］利用軟件快速計算樣品稀釋倍數，構建的BOD 檢測系統可以用于高BOD的飲料工業廢水的檢測，若樣品中含有大量重金屬離子，會影響微生物活性。Qian Zhengrong 等人［16］研究發現通過加入有機螯合劑EDTA 或DDTC 等可使重金屬離子形成金屬絡合物，從而減輕重金屬離子對檢測的影響。由于BOD 微生物傳感器的反應時間較短，若樣品中含有難生物降解的有機物將嚴重影響檢測，可以先將難以快速生物降解的有機物催化分解，再進行微生物降解。Chee Gab Joo 等人［30］利用臭氧分解產生的自由基分解樣品中難以生物降解的有機物，然后用BOD 傳感器進行檢測。臭氧預處理后1 mg/L BOD 溶液的響應強度可達處理前的1.6 倍，傳感器檢測下限為0.5 mg/L，響應時間縮短至5 min，標準偏差明顯減小。該研究組還探索了一種光催化預處理方法［32］。利用TiO2作光催化劑，僅曝光4 min 即可對樣品進行降解預處理。此外，利用電化學氧化過程［33］、超聲和加熱處理［34］等人也可對有機物進行降解預處理。

2.2 標準溶液的選取

對BOD 傳感器進行標定時，國標采用的標準溶液是GGA 溶液，即150 mg/L 谷氨酸和150 mg/L 葡萄糖溶液的混合液，其BOD 值為(198±31)mg/L。很多BOD 傳感器的標定以GGA 溶液作為標準溶液［3，4，16，17］。但是GGA 溶液用作標準溶液存在一些缺陷:GGA 溶液僅含2 種有機物，葡萄糖是大多數微生物的碳源，而谷氨酸一般需要較長時間才能被分解。因此，一些BOD 微生物傳感器選擇OECD溶液(organization for economic cooperation and development solution)作為標準溶液進行標定［35］。此外，AWW(artificial wastewater)也可用作標準溶液。Liu Changyu 等人［19］利用AWW 作為標準溶液，自來水作為空白溶液進行標定，避免了磷酸緩沖液引入的二次污染，可實現太湖水樣BOD 的快速檢測。標準溶液的選取與檢測方法和廢水的類型有關，選取適當的標準溶液可以提高傳感器檢測的準確度。

2.3 測定條件的優化

測定過程中，微生物受環境影響很大。pH 可以改變細胞膜的帶電荷狀態，影響細胞對營養物質的吸收和代謝過程中酶的活性。溫度影響微生物中酶和蛋白質的合成和活性。不同微生物生長代謝所需pH 和溫度不同，所以，需要針對所選微生物進行調節［6，9］。此外，測試過程中的緩沖溶液濃度、微生物培養時間、傳感器響應時間以及流動注射系統中溶液流速等都需要進行優化。

2.4 測定方法的選擇

BOD 檢測方法可分為穩態法和起始速率法。穩態法是測定樣品反應前后輸出的2 個穩定值，求差值ΔI 進行計算，輸出信號與微生物的數量、生存能力和呼吸速率有關。該方法具有良好的穩定性和重復性，檢測下限低，但檢測時間和恢復時間都較長。起始速率法是檢測加入樣品后輸出信號的變化率(dI/dt)，輸出信號受有機物和氧氣的傳質速率影響。該方法檢測靈敏度高，線性范圍寬，響應時間和恢復時間均較短，但易受整個測試系統不穩定因素的影響，穩定性不如穩態法［36］。

2.5 提高信號強度

一般的，BOD 傳感器固定的微生物量有限，水中O2溶解度較低，導致輸出信號微弱不易檢測。如1.3.3 中提到的，可以使用媒介體參與反應，以消除因水中O2溶解度小引起的信號強度限制。從菌種角度出發，可選用廣譜性好的菌種。從樣品角度出發，可進行預處理將難降解有機物分解，便于微生物的代謝。此外，有研究發現，菌種處于“饑餓”狀態會表現出更強的外源代謝能力。Yoshida N 等人［35］選擇在使用前處于有氧、無營養物質的溶液(0.1 mol/L NaCl 溶液)中培養的微生物制備傳感器，輸出信號提高約7 倍，避免了使用前復雜的預處理過程。

3 有待研究和解決的問題

1)由于BOD5和BOD 微生物傳感器的檢測機理不完全一致，BOD5可以檢測到難降解和易降解的有機物，而BOD 微生物傳感器由于檢測時間短只能檢測易降解有機物。盡管2 個變量線性相關顯著，但它們之間的內在聯系還有待充分的研究和驗證，需要對檢測機理做進一步深入的研究。

2)傳感器通用性有待提高。不同水體的BOD 含量相差甚遠，主要有機污染物不同，干擾物質也不同。因此，目前針對不同類型的廢水設計出了特定的BOD 傳感器［16，23］。研究人員正在探索通用型BOD 傳感器。Raud Merlin 等人［37］將固定有不同微生物的BOD 傳感器組成陣列，利用所選微生物對特定物質的降解性，運用PLS(partial least squares)回歸方法處理數據，實現對含有不同難降解有機物OECD 廢水的BOD 測定。若要使BOD 檢測走向規范化和標準化，研究人員仍需進一步探索歸一化、通用化的檢測原理和方案。

3)傳感器檢測穩定性和一致性有待提高。目前，BOD微生物傳感器雖有部分進行了商業化，但大部分仍處于實驗室研究階段。微生物的穩定性、微生物固定的一致性和微生物膜活性減弱導致的更換等都將影響BOD 微生物傳感器的性能，故其要投入應用，還需提高其穩定性和一致性。

4)微生物傳感器的微型化、集成化程度不夠，難以進行實時在線監測。目前商業化的BOD 微生物傳感器的體積和質量均偏大，不能完全達到便攜式的要求。Yang Zhen等人通過引入對照組電極(不固定微生物)，僅測量實驗組和對照組電極參數之間的差值即可實現BOD 測定，省去了攪拌子和充氣泵等設備。研究人員也在探索將微電極、微加工技術等應用于微生物傳感器以實現整個傳感器系統的微型化和便攜化。

4 結束語

BOD 檢測對于水質和一些生化過程的監測具有重要意義。由于傳統BOD5存在耗時長，重現性差，易受干擾等問題，BOD 的快速測定成為發展方向。今后須結合生物技術與信號處理技術，在保證生物活性的基礎上，提高固定的穩定性與一致性，實現對各類廢水的統一檢測。另外，應進一步結合微生物檢測與微加工技術，促進傳感器的微型化與集成化。

［1］ HJ 505—2009.水質五日生化需氧量(BOD5)的測定稀釋與接種法［S］.

［2］ Mohamad Ali Fulazzaky.Measurement of biochemical oxygen demand of the leachates［J］.Environ Monit Assess，2013(185):4721－4734.

［3］ Karube I，Matsunaga T.Microbial electrode BOD sensors［J］.Biotechnology and Bioengineering，1977，19(7) :1535－1541.

［4］ Yang Zhen，Sasaki Satoshi，Karube Isao，et al.Fabrication of oxygen electrode arrays and their incorporation into sensors for measuring biochemical oxygen demand［J］.Analytica Chimica Acta，1997(357):41－49.

［5］ 李洛娜，鈕玉龍，李 捷，等.BOD 微生物傳感檢測儀中高效微生物膜的研究［J］.環境工程學報，2009，3(3):437－441.

［6］ Sakaguchi T，Kitagawa Kei，Ando Tomotsugu，et al.A rapid BOD sensing system using luminescent recombinants of Escherichia coli［J］.Biosensors and Bioelectronics，2003(19):115－121.

［7］ Nakamura H，Abe Yuta，Koizumi Rui，et al.A chemiluminescence biochemical oxygen demand measuring method［J］.Analytica Chimica Acta，2007(602):94－100.

［8］ Nakamura H，Suzuki Kyota，Ishikuro Hiroaki，et al.A new BOD estimation method employing a double－mediator system by ferricyanide and menadione using the eukaryote Saccharomyces cerevisiae［J］.Talanta，2007(72):210－216.

［9］ Arlyapov V，Kamanin Stanislav，Ponamoreva Olga，et al.Biosensor analyzer for BOD index express control on the basis of the yeast microorganisms Candida maltosa，Candida blankii，and Debaryomyces hansenii［J］.Enzyme and Microbial Technology，2012(50):215－220.

［10］Arlyapov V A，Yudina N Yu，Asulyan L D，et al.BOD biosensor based on the yeast Debaryomyces hansenii immobilized in poly(vinyl alcohol)modified by N－vinylpyrrolidone［J］.Enzyme and Microbial Technology，2013(53):257－262.

［11］Kumlanghan A，Kanatharana Proespichaya，Asawatreratanakul Punnee，et al.Microbial BOD sensor for monitoring treatment of wastewater from a rubber latex industry［J］.Enzyme and Microbial Technology，2008(42):483－491.

［12］Liu J，Olsson Gustaf，Mattiasson Bo.Short－term BOD(BODst)as a parameter for on－line monitoring of biological treatment process—Part I:A novel design of BOD biosensor for easy renewal of bio－receptor［J］.Biosensors and Bioelectronics，2004(20):562－570.

［13］Tan T C，Qian Zhenrong.Dead Bacillus subtilis cells for sensing biochemical oxygen demand of waters and wastewaters［J］.Sensors and Actuators B，1997(40):65－70.

［14］Kim Mal Nam，Park Kyoung Hwa.Immobilization of enzymes for Klebsiella BOD sensor［J］.Sensors and Actuators B，2004(98):1－4.

［15］Chan Chiyui，Lehmann Matthias，Chan Kinman，et al.Designing an amperometric thick－film microbial BOD sensor［J］.Biosensors and Bioelectronics，2000(15):343－353.

［16］Dhall P，Kumar Anil，Joshi Abha，et al.Quick and reliable estimation of BOD load of beverage industrial wastewater by developing BOD biosensor［J］.Sensors and Actuators B，2008(133):478－483.

［17］Liu Ling，Shang Li，Guo Shaojun，et al.Organic－inorganic hybrid material for the cells immobilization:Long－term viability mechanism and application in BOD sensors［J］.Biosensors and Bioelectronics，2009(25):523－526.

［18］Wang Jianlong，Zhang Yixin，Wang Yeyao，et al.An innovative reactor－type biosensor for BOD rapid measurement［J］.Biosensors and Bioelectronics，2010(25):1705－1709.

［19］Liu Changyu，Dong Shaojun.Field application of a biofilm reactor based BOD prototype in Taihu Lake，China［J］.Talanta，2013(109):147－151.

［20］Ivandini T A，Saepudin Endang，Wardah Habibah，et al.Development of a biochemical oxygen demand sensor using gold－modified boron－doped diamond electrodes［J］.Anal Chem，2012( 84):9825－9832.

［21］Pang Hei Leung，Kwok Nga Yan，Chan Pak Ho，et al.Highthroughput determination of biochemical oxygen demand(BOD)by a microplate－based biosensor［J］.Environ Sci Technol，2007(41):4038－4044.

［22］Bonetto M C，Sacco Natalia J，Ohlsson Astrid Hilding，et al.Assessing the effect of oxygen and microbial inhibitors to optimize ferricyanide－mediated BOD assay［J］.Talanta，2011(85):455－462.

［23］Oota S，Hatae Yuta，Amada Kei，et al.Development of mediated BOD biosensor system of flow injection mode for shochu distillery wastewater［J］.Biosensors and Bioelectronics，2010(26):262－266.

［24］Liu Ling，Zhang Shengsen，Xing Li，et al.A co－immobilized mediator and microorganism mediated method combined pretreatment by TiO2nanotubes used for BOD measurement［J］.Talanta，2012(93):314－319.

［25］佟 萌，杜竹偉，李頂杰，等.微生物燃料電池型傳感器在BOD 檢測中的應用進展［J］.環境監測管理與技術，2008，20(6):7－12.

［26］吳 鋒，劉 志，周順桂，等.低成本單室微生物燃料電池型BOD 傳感器的研制［J］.環境科學，2009，30(10):3099－3103.

［27］Hideaki Nakamura，Shun Kobayashi，Yu Hirata，et al.A spectrophotometric biochemical oxygen demand determination method using 2，6－dichlorophenolindophenol as the redox color indicator and the eukaryote Saccharomyces cerevisiae［J］.Analytical Biochemistry，2007(369):168－174.

［28］Zheng Ruijuan，Fang Yimin，Qin Sufang，et al.A dissolved oxygen sensor based on hot electron induced cathodic electrochemiluminescence at a disposable CdS modified screen－printed carbon electrode［J］.Sensors and Actuators B，2011(157):488－493.

［29］Zhang Jinzhong，Bao Lili，Yao Shouzhuo，et al.A series piezoelectric quartz crystal microbial sensing technique used for biochemical oxygen demand assay in environmental monitoring［J］.Microchemical Journal，1999，62(3):405－412.

［30］Qian Zhengrong，Tan T C.BOD measurement in the presence of heavy metal ions using a thermally－killed－Bacillus subtilis biosensor［J］.Water Research，1999，33(13):2923－2928.

［31］Chee Gab Joo，Nomura Yoko，Ikebukuro Kazunori，et al.Stoppedflow system with ozonizer for the estimation of low biochemical oxygen demand in environmental samples［J］.Biosensors and Bioelectronics，2007(22):3092－3098.

［32］Chee Gab Joo，Nomura Yoko，Ikebukuro Kazunori，et al.Biosensor for the evaluation of biochemical oxygen demand using photocatalytic pretreatment［J］.Sensors and Actuators B，2001(80):15－20.

［33］Liu Lei，Zhao Guohua，Pang Yaning，et al.Integrated biological and electrochemical oxidation treatment for high toxicity pesticide pollutant［J］.Ind.Eng Chem Res，2010(49):5496－5503.

［34］Serkan Sahinkaya，Mehmet Faik Sevimli.Sono－thermal pre－treatment of waste activated sludge before anaerobic digestion［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2013(20):587－594.

［35］Yoshida N，Hoashi J，Morita T，et al.Improvement of a mediatortype biochemical oxygen demand sensor for on－site measurement［J］.Journal of Biotechnology，2001(88):269－275.

［36］Velling Siiri，Tenno Toomas.Different calibration methods of a microbial BOD sensor for analysis of municipal wastewaters［J］.Sensors and Actuators B，2009(141):233－238.

［37］Raud Merlin，Kikas Timo.Bioelectronic tongue and multivariate analysis:A next step in BOD measurements［J］.Water Research，2013(47):2555－2562.