池蝶蚌CyPA的應激表達及對Hela細胞生長的影響

羅 春徐 靈何 靜史建伍盛軍慶彭 扣王軍花黃 濱洪一江

(1. 南昌大學生命科學與食品工程學院, 南昌 330031; 2. 江西省水產技術推廣站, 南昌 330046)

池蝶蚌CyPA的應激表達及對Hela細胞生長的影響

羅 春1徐 靈1何 靜1史建伍1盛軍慶1彭 扣1王軍花1黃 濱2洪一江1

(1. 南昌大學生命科學與食品工程學院, 南昌 330031; 2. 江西省水產技術推廣站, 南昌 330046)

研究分析了池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)親環蛋白A(Cyclophilin A, CyPA)誘導的應激反應和對Hela細胞生長的影響。采用嗜水氣單胞桿菌誘導刺激池蝶蚌, 并利用Real-time PCR技術對其肝臟、性腺和血淋巴中CyPA基因mRNA的表達量進行分析, 應激實驗表明, 在嗜水氣單胞桿菌刺激后血淋巴、肝臟和性腺中的CyPA在誘導 4h出現一個表達峰, 8h后開始下降, 說明池蝶蚌 HsCyPA基因參與免疫防御應答反應; 利用pET-32a(+)表達載體, 根據HsCyPA基因cDNA的序列, 構建了含有完整開放閱讀框(ORF)的表達載體并在大腸桿菌BL21(DE3)中進行原核表達, 優化誘導條件后, 通過親和層析獲得了含量較高的上清可溶性蛋白; 采用MTT法, 將原核表達的重組CyPA蛋白稀釋到相應(50、100、200、400和800 ng/mL)濃度, 刺激Hela細胞系后發現, 重組池蝶蚌 CyPA蛋白能促進 Hela細胞生長, 刺激濃度為 100 ng/mL時, 達到最大增殖率18.5%。結果初步表明, 池蝶蚌 CyPA是一個既參與免疫應激又對細胞的生長發育具有影響的功能廣泛的蛋白質。

池蝶蚌; 親環蛋白A; Real-time PCR; 原核表達; Hela細胞; MTT法

親環素家族(Cyclophiins, Cyps)是一類廣泛分布于自然界、具有高度保守性的多功能蛋白家族, 它們是免疫抑制劑環孢素A(Cyclophilins, CsA)細胞內受體又稱為CsA結合蛋白[1]。當前, 對CyPA主要集中于其在不同生物體內的分布、相關蛋白序列的分析、結構及其重要的生物學功能等領域的研究[2]。諸多研究結果顯示CyPA與腫瘤的發生密切相關。Qian等[3]通過RNA干擾技術抑制CyPA在非小細胞肺癌細胞中的表達, 通過細胞增殖實驗和克隆形成實驗, 發現CypA表達的下調導致了非小細胞肺癌細胞的增殖明顯下降。運用蛋白質組學和細胞生物學的方法發現, CyPA在食管鱗癌[4]、男性乳腺癌[5]、前列腺癌[6]、頭頸部腫瘤[7]和舌鱗狀細胞癌[8]等腫瘤中的表達也明顯上調, 參與其惡性的生物學行為。相關研究報道, CypA的分子伴侶功能對在形成腫瘤中不當的信號激活造成的條件復合物的錯誤折疊和斷裂的修復起著很重要的作用, 并且維持蛋白的穩態, 這很可能是腫瘤生存的關鍵[9]。此外, CyPA基因可作為一個免疫抑制劑參與病毒復制的中間過程,參與機體的免疫機制[12]; 研究還發現, 哺乳動物中的CyPA基因對抵御病毒感染起著重要的角色[13], 表明CyPA基因參與先天免疫機制。近年來研究發現, CyPA在櫛孔扇貝以及斑節對蝦等水生生物中可能充當一種免疫應激的角色[10,11]。

池蝶蚌屬軟體動物門、瓣鰓綱、蚌科、帆蚌屬,具有優良的育珠及抗病性能[14]。從用滅活的嗜水氣單胞菌刺激的池蝶蚌文庫中獲得了HsCyPA的cDNA全長1229 bp, 完整的開放性閱讀框編碼164個氨基酸; 池蝶蚌CyPA除了是一種組成型蛋白, 存在肽基脯酰順反異構酶活性外, 可能在水生生物的病原感染防御中同樣發揮重要作用[15]。到目前為此, 還沒有淡水貝類中有關CyPA功能研究的報道。本研究用嗜水氣單胞菌對池蝶蚌進行誘導, 實時熒光定量PCR檢測池蝶蚌肝臟、性腺、血淋巴中的CyPA的表達情況, 初步探討CyPA基因在池蝶蚌免疫應答中的作用。同時通過原核表達純化獲得的池蝶蚌的融合CyPA, 用MTT法研究其對Hela細胞生長的影響, 為進一步了解淡水珍珠貝類CyPA的功能奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌、pET-32a載體、大腸桿菌BL21(DE3)為本實驗室永久保存種, 池蝶蚌采自江西撫州市洪門水庫的國家級池蝶蚌良種場。池蝶蚌取回后放置于實驗室水族箱中暫養, 水溫控制在18—25 ℃ ,每天上下午換曝氣的水各一次。各組織樣品取材于4齡健康池蝶蚌, 誘導組(嗜水氣單胞菌刺激2h、4h、8h、16h、24h、48h)。Hela細胞系從康為世紀生物公司購買, 各種分子生物學試劑分別購自ABI、TaKaRa、Invitrogen 及Sigma 等公司。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

取經過菌刺激過后的池蝶蚌的性腺、肝和血淋巴和沒經過菌刺激的性腺, 用Invitrogen公司的TRIzol Reagent提取總RNA, 按照Invitrogen公司的Super Script Ⅱ Reverse Transcriptase Kit的方法合成cDNA。然后用瓊脂糖凝膠和UV檢測RNA純度。

1.3 PCR引物設計

根據實驗室所獲得的池蝶蚌 CyPA基因 cDNA全長序列, 設計 CyPA的熒光定量 PCR引物CyPA-1、CyPA-2, 管家基因選擇池蝶蚌的β-肌動蛋白基因(β-actin), 設計的引物為A-R-1、A-R-2; 同時選定包括全部ORF在內的大小約為650 bp的片段用于表達蛋白, 設計的引物CyPA-up、CyPA-low加入了EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內切酶位點和保護堿基,設計的引物如表1所示。

表1 熒光定量PCR所用CyPA基因熒光定量引物和β-actin的引物及CyPA表達的擴增引物Tab.1 Primers used for Real-time PCR and CyPA Expression in this study

1.4 池蝶蚌CyPA熒光定量PCR檢測、蛋白表達目的片段PCR

以菌刺激過的不同時間段的性腺、肝和血淋巴的cDNA作為模板, 進行熒光定量檢測, 每個組織做3個平行樣, 重復3次實驗; 以池蝶蚌性腺組織cDNA為模板, 用特異性表達引物進行PCR反應, 擴增表達蛋白的目的片段。熒光定量PCR的反應體系為25 μL, SYBR Premix Ex TaqTM(2×)8 μL, cDNA模板 2 μL, 上游引物1 μL, 下游引物1 μL, ddH2O 8 μL, 反應條件為95 ℃ 5min, 95 ℃ 30s, 50 ℃ 30s, 72 ℃ 30s, 35個循環; 擴增蛋白表達片段的反應體系為50 μL, 10×PCR buffer 5 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, cDNA模板2 μL, 上游引物(10 mmol/L)1 μL,下游引物(10 mmol/L)1 μL, HiFi Polymerase (5 U/μL) 0.5 μL, ddH2O 39.5 μL, 反應條件為94 ℃ 4min, 94℃30s, 58 ℃ 30s, 72 ℃ 30s, 35個循環, 72 ℃ , 10min。擴增片段經過割膠回收后, 再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, DNA–20℃貯存備用。采用2–△△Ct法計算分析定量的相對表達值[16]。運用SPSS軟件分析CyPA mRNA在池蝶蚌中的表達情況, P＜0.05差異顯著, P＜0.01差異極顯著。

1.5 池蝶蚌pET-32a-CyPA重組質粒的構建與鑒定將回收獲得目的片段與具有氨芐青霉素(Amp)抗性的pET-32a Expression Vectors用EcoRⅠ和XhoⅠ兩種限制性內切酶進行雙酶切處理, 然后用T4 DNA 連接酶將質粒酶切產物與DNA酶切產物進行酶聯, 然后將重組質粒轉入到感受態細胞中進行轉化, 通過在具有氨芐青霉素(Amp)抗性的固體培養基中挑克隆, 通過菌液PCR陽性檢測目的片段,陽性克隆菌液送至上海生工生物工程有限公司測序。將正確的陽性克隆接種至20 mL LB培養基, 當菌液A600值約為0.6左右時用質粒小抽提試劑盒提重組質粒, 質粒保存在–20℃冰箱備用。

1.6 池蝶蚌CyPA原核表達及其蛋白純化

將構建好的重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中, 重組菌于37℃振蕩過夜, 取200 μL接種于20 mL LB (50 μg/mL Amp)液體培養基中, 37℃、200 r/min恒溫搖床振蕩培養至A600為0.6—0.8時, 取出1 mL菌液作為誘導前對照, 其他加入IPTG至終濃度為1 mmol/L, 然后繼續以相同培養條件培養, 分別在培養1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h和8h后各吸取1 mL菌液作為誘導組菌液, 最后收集菌體,用SDS-PAGE膠進行分析。為了獲得蛋白含量較高的上清, 根據閆嘯等[17]的方法在蛋白誘導的過程中對其條件進行了相應的優化: 低溫誘導和培養基優化。在確定最佳表達條件和時間后, 進行大量誘導,通過超聲波破碎收集上清和包涵體, 采用N端帶有6個連續組氨酸的親和層析柱, 利用金屬離子螯和柱進行親和層析純化。

1.7 MTT法檢測池蝶蚌重組CyPA對Hela細胞增殖的影響

用胰酶消化對數生長期的Hela細胞, 按2×103細胞/孔接種于96孔板, 在正常條件下培養過夜, 然后用無血清RPMI-1640培養基洗滌細胞3次后, 加入含0.1%胎牛血清RPMI-1640培養基, 繼續培養24h, 使細胞均一化, 同時將活性和煮沸的重組蛋白CyPA用0.1%胎牛血清的RPMI-1640培養基稀釋至不同濃度(50、100、200、400、600和800 ng/mL), 在無血清RPMI-1640培養基洗滌細胞3次后, 每孔加入200 μL含不同CyPA蛋白濃度的培養基, 對照組加入等量不含CyPA的0.1%胎牛血清的RPMI-1640培養基, 繼續培養, 在細胞培養72h后, 每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL, 37℃繼續孵育4h; 吸去培養基, 每孔加入200 μL DMSO溶液, 搖床避光振搖直至顯微鏡下觀察板孔內藍色結晶物完全溶解, 然后在酶標儀上檢測A570值。

2 結果

2.1 嗜水氣單胞菌誘導池蝶蚌CyPA基因在性腺、肝臟和血淋巴中不同時間段的表達

通過熒光定量PCR檢測池蝶蚌CyPA基因在嗜水氣單胞桿菌誘導下在性腺、肝臟和血淋巴不同時間段的表達差異: 池蝶蚌CyPA基因在性腺、肝臟和血淋巴在誘導2h時, 發現已經開始出現上調, 在誘導4h均達到表達峰值, 除了性腺在誘導48h出現小幅度的上調, 肝臟在16h出現小幅度上調外, 3個組織的表達量基本出現下調趨勢, 肝臟和血淋巴在誘導48h后的表達量最低(圖1—3)。

圖1 不同誘導時間池蝶蚌肝臟中CyPA表達的變化Fig. 1 Change of CyPA gene expression level in liver of H. schlegelii after A. hydrophila stimulation at different times

圖2 不同誘導時間池蝶蚌性腺中CyPA表達的變化Fig. 2 Change of CyPA gene expression level in gonad of H. schlegelii after A. hydrophila stimulation at different times

2.2 CyPA蛋白表達目的片段和目的片段陽性檢測及其重組質粒雙酶切鑒定

用特異性表達引物進行PCR擴增獲得的產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測, 在650 bp左右, 與目的片段大小相同; 菌液PCR陽性檢測結果與上海生工測序一致; EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切構建好的重組質粒pET-32a-CyPA, 得到了與預期片段大小相符的外源基因片段, 驗證了目的表達片段。

2.3 CyPA融合蛋白的誘導表達及其純化

將重組質粒pET-32a-CyPA轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中, 重組菌通過IPTG誘導表達CyPA融合蛋白, 未誘導的重組菌作為對照組, 對各誘導時間菌體進行變性不連續SDS-PAGE膠電泳, 發現在1—8h 里均出現了一條相對分子量約37 kD的蛋白條帶, 但在對照組0h中沒有出現類似的條帶, 說明重組菌成功表達了CyPA融合蛋白; 用His-Bind Kit (Novagen公司)純化帶(His)6-標簽的CyPA上清, 包涵體用KCL染色切膠回收法, 檢測結果表明純化效果較好, 得到了單一的目的條帶。通過比較LB培養基誘導, LB培養基低溫誘導和甘露醇培養基低溫誘導三者之間純化的結果, 發現在甘露醇培養基低溫誘導條件下蛋白表達量最高。

2.4 池蝶蚌重組CyPA對Hela細胞增殖的影響

MTT法是檢測活細胞最直接的實驗方法, 實驗測得OD值的高低與活細胞成正比。實驗用池蝶蚌CyPA刺激Hela細胞, 進行MTT法毒性實驗, 通過酶標儀檢獲得OD值來分析對細胞的生長情況。結果如表2所示, 活性的CyPA對Hela細胞有顯著的促進作用(P＜0.05), 最佳刺激濃度是100 ng/mL, 此時A570的平均值為1.1509(±0.05), 對照組是0.9704 (±0.05), 通過增長率的計算方法得出最大增殖率為18.5%; 濃度小于100 ng/mL時, 刺激作用逐步上升, 但當濃度大于100 ng/mL時, 刺激效果呈現下降趨勢。將CyPA煮沸 5min, 將變性失活的蛋白稀釋到相同濃度來刺激Hela細胞, 結果顯示, 煮沸后的CyPA蛋白的作用顯著降低, A570在0.9160—0.9808。[增殖率=(實驗組A570–對照組A570)/對照組A570]

3 討論

圖3 不同誘導時間池蝶蚌血淋巴中CyPA表達的變化Fig. 3 Change of CyPA gene expression level in haemocytes of H. schlegelii after A. hydrophila stimulation at different times

表2 MTT法檢測HsCyPA對Hela細胞的促增殖作用結果Tab.2 The results of HsCyPA promoting proliferation of Hela Determined by MTT assay

通過檢測池蝶蚌CyPA組織分布表達情況, 發現在肝臟和性腺中表達量顯著高于其他組織。研究發現, CyPA在性腺、肝臟和血淋巴中的表達量高于其他組織, 在防御病原菌感染機制中也擔當相關角色[13]。在無脊椎動物中并沒有發現B細胞抗體介導的體液免疫機制和T細胞介導的細胞免疫反應機制, 主要是通過血淋巴、肝胰腺及一些體液免疫因子參與機體的免疫防御來行使免疫功能[18,19]。通過用嗜水氣單胞桿菌對池蝶蚌進行刺激后, 發現CyPA在血淋巴中的mRNA表達量發生顯著變化, CyPA mRNA的表達量在誘導4h后顯著上升(P＜0.01), 并達到峰值,說明CyPA在血細胞免疫防御細菌感染機制中起作用。在性腺中, CyPA mRNA的表達量在誘導4h后顯著上升(P＜0.01), 并達到峰值, 誘導2h后池蝶蚌性腺CyPA的表達量已經開始上升, 誘導8h后出現下降趨勢, 誘導24h后表達量降到最低, 48h表達量出現小幅度的上調, CyPA在肝臟中的表達水平也出現了相似的表達趨勢。Song等[12]在研究櫛孔扇貝CyPA時同樣發現, 經鰻弧菌(Vibrio anguillarum)誘導4h后性腺中CyPA表達量顯著增加, 和本實驗結果相吻合,進一步證實CyPA在貝類防御細菌感染方面起著重要作用。Yeh等[20]研究中也發現, 經愛德華桿菌誘導的斑點叉尾(Lepisosteus oculatus)卵巢細胞中CyPA表達量明顯增加, 表明CyPA在愛德華桿菌感染早期階段扮演防御的角色。Qiu等[13]發現在斑節對蝦(Penaeus monodon)中CyPA基因, 用LPS刺激后在肝胰腺中表達量也出現顯著上調, 再次證實CyPA對防御細菌感染起著重要作用。綜上得出: 在嗜水氣單胞菌刺激后, 池蝶蚌CyPA在性腺、血淋巴和肝臟中表達量很高, 在4h時表達水平達到峰值, 說明池蝶蚌的CyPA在性腺、血淋巴和肝臟的防御外來細菌機制中起著重要作用, 然而CyPA在對貝類免疫機制仍然有許多未知, 仍需要進一步深入研究。

已有報道發現, CyPA在子宮內膜癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥組織中表達明顯上調, 并證實外源性的 CyPA蛋白能促進宮內膜癌癌細胞、胰腺癌細胞以及肝癌細胞的增殖[21,24], 研究還發現肝癌細胞組織和細胞系中 CyPA表達上調可能參與肝癌細胞趨化作用、遠處轉移、抗凋亡等過程[25,26]。在研究肺癌過程中 Yang等[27]比較了不同的肺癌細胞系和正常肺細胞系中 CyPA的表達水平情況, 篩選到了一株CyPA相對表達最高的肺癌細胞株H446, 并發現在外源重組CyPA的刺激下對H446細胞的增殖起到了一定的上調作用; Li等[28]證實, CyPA在人胰腺癌細胞中過度表達可通過與其受體EMMPRIN的結合促進腫瘤細胞增殖。在胰腺癌患者中, CyPA的表達與腫瘤大小, TNM分期, 淋巴轉移及CA199的表達也相關[29]。為了研究池蝶蚌 CyPA是否具有促進細胞增生功能, 本研究采用池蝶蚌CyPA對Hela細胞進行了體外刺激實驗, 通過MTT法毒性實驗, 相對于對照組, 發現在加入了高濃度活性重組 CyPA蛋白的Hela細胞生長更快, 這一現象也首次證實了淡水珍珠蚌池蝶蚌CyPA對Hela細胞有一定促進細胞增殖的作用。池蝶蚌CyPA這種對Hela細胞的生長有促進作用, 可能與CyPA具有PPIase活性有關,在氧化應激條件下, 它能介導活性氧遞質對細胞外信號調節激酶-1和2的激活, 通過增加癌細胞的增殖和抗凋亡能力, 調整促癌信號來促進細胞有絲分裂, 最終達到 Hela細胞的增殖作用。綜上表明, 池蝶蚌 CyPA是一個功能廣泛的分子, 相關功能及其作用機制有待更加進一步深入的研究。

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THE EXPRESSION OF CYCLOPHILIN A (CyPA) IN HYRIOPSIS SCHLEGELII IN RESPONSE TO PATHOGENS AND ITS EFFECT ON THE GROWTH OF HELA CELLS

LUO Chun1, XU Ling1, HE Jing1, SHI Jian-Wu1, SHENG Jun-Qing1, PENG Kou1, WANG Jun-Hua1, HUANG Bin2and HONG Yi-Jiang1
(1. School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China; 2. Jiangxi Province Fisheries Technology Extension Station, Nanchang 330046, China)

In this study we explored the expression of Hyriopsis schlegelii Cyclophilin A in response to infection and the effect of this protein on the growth of Hela cells. The mRNA level of this gene in the haemocytes, liver and gonad was measured with Real-time PCR after the Aeromonas hydrophila challenge. It was observed that the transcription of HsCyPA in haemocytes, gonad and liver was significantly up-regulated at 4h after the challenge and then decreased at 8h. These results suggested that HsCyPA might be involved in the immune response. The complete ORF of HsCyPA gene was subcloned into pET-32a (+) prokaryotic expression vector, and then expressed in E. coli BL21 (DE3). After the optimization of induction conditions, the soluble fusion protein was purified with Ni-NTA affinity chromatography. To test the effect of this recombinant protein on Hela cells, we diluted it into certain concentrations (50, 100, 200, 400, 800 ng/mL) and applied them into Hela cell strains through MTT assay. It was revealed that the recombinant HsCyPA could promote the proliferation of Hela cells, and the proliferation rate reached the maximum (18.5%) when the HsCyPA concentration was 100 ng/mL. These preliminary results indicated that Cyclophilin A could be a multi-functional protein which might participate in immune responses and cell growth regulation.

Hyriopsis schlegelii; Cyclophilin A; Real-time PCR; Prokaryotic Expression; Hela cell; MTT assay

S944.4

A

1000-3207(2015)03-0475-07

10.7541/2015.63

2014-06-16;

2014-11-05

國家自然科學基金(31160534); 江西省科技落地計劃(KJLD12001); 江西省自然科學基金(20122BAB204016)資助

羅春(1988—), 男,江西贛州瑞金人; 碩士; 主要研究方向水生生物遺傳育種學。E-mail: 517684206@qq.com

洪一江(1963—),男,福建南安人; 教授, 博導; 主要研究方向為水生動物遺傳育種學。E-mail: yijianghong@126.com