禽傳染性支氣管炎病毒M41株反向遺傳株的構建

李 然 許記剛 吳 暄 姬高升 楊 鑫 王紅寧

(四川大學生命科學學院,動物疫病防控與食品安全四川省重點實驗室,生物資源與生態環境教育部重點實驗室,“985工程”西南資源環境與災害防治科技創新平臺,四川成都 610064)

禽傳染性支氣管炎病毒M41株反向遺傳株的構建

李 然 許記剛 吳 暄 姬高升 楊 鑫 王紅寧*

(四川大學生命科學學院,動物疫病防控與食品安全四川省重點實驗室,生物資源與生態環境教育部重點實驗室,“985工程”西南資源環境與災害防治科技創新平臺,四川成都 610064)

禽傳染性支氣管炎病毒是目前危害禽養殖業的重大傳染病之一。由于病毒基因組大、操作困難，給研究其基因組結構開發有效的疫苗帶來了困難。本研究在對IBV M41毒株全基因組序列測序的基礎上用DNAStar軟件的MapDraw程序分析酶切位點的分布情況，將全基因組分為14段分段擴增。采用Primer6設計含No See’m酶切位點，在5’端引入T7啟動子核心序列的引物，分段克隆于PMD19-T載體，通過引入的“No See’m式”Bsa I和BsmB I酶切位點，將亞克隆體外拼接成基因組全長cDNA。再通過5’端引入的T7啟動子核心序列對基因組全長cDNA進行體外轉錄，使用電擊的方法將全長轉錄物轉染BHK-21細胞，轉染后轉入SPF雞胚培養，鑒定成功獲得了IBV M41拯救株。為研究IBV強毒株的致病機理、毒力位點及IBV新型疫苗的研究提供了參考，奠定了基礎。

IBV M41株 反向遺傳

傳染性支氣管炎（IB）又稱為禽傳染性支氣管炎，是由冠狀病毒科的傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis Virus，IBV）引起的一種雞的常見的急性、高度傳染性疾病，是危害養禽業的重大傳染病之一。以呼吸道癥狀、產蛋雞產蛋下降、蛋品質下降、腎臟病變及胃腸道病變為主要特征（Saif Y M等，2005；Cavanagh 等，2003）。目前，IBV廣泛分布，不同毒株在組織嗜性及致病性上存在較大差異，血清型復雜，目前全世界已經發現幾十種IBV血清型，由于血清型眾多，不同血清毒株交叉保護弱，新的變異毒株不斷出現，導致禽傳染性支氣管炎不斷爆發（Zou N L等，2010；Kulkarni A B 等，2010）。每年造成的經濟損失超過十億元，當前尚無治療IB的特效藥，疫苗免疫成為IBV防控的主要手段（王紅寧，2000）。

對RNA病毒而言，反向遺傳學技術主要指全長cDNA感染性克隆技術，包括病毒基因組全長cDNA的克隆拼接技術和由全長cDNA轉錄獲得感染性轉錄體制備技術。該技術能在病毒DNA水平上對其進行人工操作，解決了RNA病毒基因組難以操作的難題，從而為RNA 病毒的基因復制與表達調控機理研究，新疫苗的研制等提供了強有力的技術手段。自1978年Taniguchil首次對RNA病毒噬菌體Qβ進行反向遺傳操作（Taniguchi and Weissmann，1978）以來，已有大量RNA病毒反向遺傳操作的報道。禽冠狀病毒傳染性支氣管炎病毒IBV的反向遺傳操作主要集中在Beaudette株反向遺傳研究。Casais R等（2001）痘苗病毒載體成功建立了IBV反向遺傳操作技術，發現S蛋白是IBV組織嗜性的決定子，也是主要免疫原性基因。Casais R等（2005）發現基因5是IBV復制非必需的基因。Hudgson T等（2006）在Casais前期的工作基礎上，對IBV的基因3（3ab）的功能進行了研究，結果發現基因3也是復制非必需的基因。美國學者Youn S等（2005）和新加坡學者Fang S等（2007）分別也分別建立了IBV的反向遺傳體系。在國外學者對Beaudette株反向遺傳研究的基礎上目前我國也已經成功構建了H120的反向遺傳（Ying Shun Zhou，2013）。國內外對IBV的研究均集中于弱毒株的反向遺傳操作，但是對強毒株的反向遺傳構建，及毒力位點致病機理的研究有待完善，因此本研究在實驗室前期工作的基礎上選擇IBV M41株作為研究對象，建立IBV強毒株的反向遺傳操作為后續進一步研究病毒的分子致病機理，重組疫苗等奠定基礎。

1 材料

1.1 毒株

IBV M41株中國獸醫藥品監察所提供，由四川大學動物疫病防控與食品安全四川省重點實驗室保存。

1.2 工具酶及主要試劑

限制性內切酶BSaI、BsmBI（NEB）；KOD-plus高保真酶（TOYOBO）；PMD19-T、DH5α、T4 DNA Ligase（Takara）；引物由上海生工生物公司合成。

2 方法

2.1 IBV M41株全基因組的分段擴增

在對IBV M41毒株全基因組測序的基礎上，用DNASTAR對其進行酶切位點的分析后將全基因組分成14段。用Primer 6設計含有No See’m酶切位點的擴增引物，在全基因組5'UTR端引入T7啟動子，在全基因組3'端引入Poly（A）尾。引物由上海生工生物工程公司合成。

Trizol法從含IBV M41株的雞胚尿囊液中提取總RNA，反轉錄成cDNA，14個片段分別用高保真酶以cDNA為模板進行PCR擴增。將各個目的片段純化后分別與PMD19-T載體連接、將獲得的連接產物轉化到DH5α感受態中，在含有氨芐西林的IPTG/X-gal固態平板上37℃過夜培養，挑取陽性克?。?～5個）進行測序正確無誤后保存菌種。

2.2 重組質粒的提取、目的cDNA片段的酶切回收

將鑒定后保存的正確無誤的菌種接種于200ml具有氨芐抗性的LB培養基中37℃過夜培養11～14h，用堿裂解法提取質粒、用聚乙二醇法純化。

分別對載有F1～F14的質粒進行酶切，將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，目的片段切膠回收，用核酸蛋白儀測定濃度。

2.3 全長cDNA的克隆拼接和感染性轉錄體的獲得

（1）在T4連接酶體系中，將F1-F4；F4-F8；F9-11；F12-14分別以等摩爾比連接。瓊脂糖電泳回收純化得到四個長度分別為6.84K、6.87K、6.86K、6.95K的1/4目的片段。

（2）將四個四分之一片段按照等摩爾比用T4連接酶連接24h獲得全長、抽提濃縮。用mMESSAGE mMACHINE Ultra T7 Kit體外轉錄試劑盒體外轉錄獲得具有感染性的全長RNA。

2.4 反向遺傳株M41-R株的鑒定

2.4.1 拯救株致病性及EID50測定

SPF雞胚孵化至10日齡；將IBV依次作10倍稀釋，進行雞胚尿囊腔接種，每個稀釋度接種0.2ml；作5個重復，同時設正常雞胚對照。置37℃培養，棄去24h內死亡胚，再孵化7d后觀察。按Reed-Muench法計算EID50。

2.4.2 HA 測定

將M41-R雞胚尿囊液用A型魏氏梭菌濾液處理，并作梯度稀釋，用0.75% 的雞紅細胞滴定，測定M41-R的紅細胞凝集效價。M41親本株、不含IBV病毒的SPF尿囊液、PBS分別作為對照。

3 結果

（1）基因組分段擴增瓊脂糖凝膠電泳結果表明成功擴增出了大小為1k～2.6k的目的片段。

（2）1/4片段連接結果如圖1，結果表明成功得到了大小為6.84K、6.87K、6.86K、6.95K的目的片段。傳拯救。冠狀病毒的基因組大，用大容量的載體來搭載其全長cDNA，操作難度大、穩定性差。為了避免以上問題，本研究采用了分段克隆、體外連接全長cDNA、體外轉錄、細胞轉染、雞胚增殖的技術路線。將全基因組分為較小片段分段克隆的策略進行研究，分段數為14個，每個片段大小在2k左右。3kb以內的外源片段長度是T載體克隆的最適長度，該設計就可以使用常規的pMD19-T載體就可成功克隆所有片段，且重組質粒的穩定性高。

圖1 1/4片段連接結果M為1kb DNA Marker；1-4泳道為1/4片段

本研究通過采用將全基因組分為較小片段進行體外擴增具有保真性高，能夠在常規克隆載體中穩定復制的優點，利用No See’m技術體外連接獲得全長，成功獲得了IBV M41株的全長cDNA，通過體外轉錄獲得具有感染性的全長RNA將體外轉錄物轉染BHK-21細胞，接種雞胚增殖，成功完成了IBV M41株的拯救，獲得反向遺傳拯救株M41-R。本研究建立了IBV M41這一經典強毒株的反向遺傳，完善了IBV的反向遺傳研究，為研究強毒株致病機理，毒力基因的研究，以及強毒株減弱后疫苗的研發等提供一個參考。

（3）全長結果

圖2 全長連接結果

M為λ -Hind III digest DNA Marker；1：全長IBV M41 cDNA連接產物

（4）EID50測定結果

接種了反向遺傳拯救株IBVM41-R的SPF雞胚能夠表現出感染IBV的典型癥狀。按Reed-Muench法計算，M41-R株的EID50為EID50=107.50/0.2ml。與親本毒株一致。

（5）HA結果

經A型魏氏梭菌濾液處理的IBV M41-R毒株尿囊液的雞紅細胞凝集價為211，與親本毒株IBV M41一致。

4 分析與討論

IBV的基因組不分節段，整個復制周期中無DNA中間體的階段。因此，IBV的反向遺傳研究，必須通過構建基因組的全長cDNA、轉錄獲得感染性的全長基因組RNA以實現病毒的反向遺

[1] 蘇敬良，高福（譯），Saif Y M主編.禽病學[M].北京：中國農業出版社，2005.

[2] 王紅寧.禽傳染性支氣管炎綜合防治[M].北京：中國農業科技出版社，2000.

[3] Cavanagh，D.，Naqi，S.. Infectious bronchitis. Diseases of poultry，2003，（11）：101-119.

[4] Casais R，Thiel V，Siddell S G，et al. Reverse genetic system for the avian coronavirus infectious bronchitis virus[J]. J Virol，2001，（75）：12359-12369.

[5] Casais R，Davies M，Cavanagh D et al，Gene 5 of the avian coronavirus infectious bronchitis virus is not essential for replication[J]. J Virol，2005，（79）：8065-8078.

[6] Fang S，Chen B，Tay F P.L.，et al. An arginine-to-proline mutation in a domain with undefined functions within the helicase protein（Nsp13）is lethal to the coronavirus infectious bronchitis virus in cultured cells[J]. Virology，2007，（358）：136-147.

[7] Hodgson T，Britton P，Cavanagh D.Neither the RNA nor the Proteins of Open Reading Frames 3a and 3b of the Coronavirus Infectious Bronchitis Virus Are Essential for Replication[J]. J Virol，2006，（80）：296-305.

[8] Kulkarni A B，Resurreccion R S.Genotyping of Newly Isolated Infectious Bronchitis Virus Isolates from Northeastern Georgia[J]. Avian Diseases，2010，54（4）：1144-1151.

[9] Taniguchi，T.，Weissmann，C.. Site-directed mutations in the initiator region of the bacteriophage Qβ coat cistron and their effect on ribosome binding[J]. Journal of Molecular Biology，1978，（118）：533-565.

[10] Youn S，Leibowitz J L，Collisson E W. In vitro assembled，recombinant infectious bronchitis viruses demonstrate that the 5a open reading frame is not essential for replication[J]. Virology，2005，（332）：206-215.

[11] Zou N L，Zhao F F，Wang Y P，et al.Genetic analysis revealed LX4 genotype strains of avian infectious bronchitis virus became predominant in recent years in Sichuan area，China[J]. Virus Genes，2010，41（2）：202-209.

[12] Zhou，Y. S.，Zhang，Y.，Wang，H. N.，Fan，et al. Establishment of reverse genetics system for infectious bronchitis virus attenuated vaccine strain H120[J]. Vet Microbiol，2003，162（1）：53-61.

國家自然科學基金“禽冠狀病毒（IBV）H120、M41、SAIBk株反向遺傳操作和毒力相關基因研究”（30972201）、現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-41-K09）、四川蛋雞產業鏈項目（2011NZ0073）

李然，碩士，從事微生物分子生物學研究。

王紅寧，女，教授，博士生導師，從事動物疾病防控、微生物基因工程研究。