縫隙連接蛋白pannexin1在神經病理性疼痛大鼠脊髓背角的表達變化

周功銳，包曉航，毛慶祥，龍宗泓，景 勝，黃 靜，楊天德

（第三軍醫大學新橋醫院麻醉科，重慶400037）

神經病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是感覺神經系統損傷引起的一種慢性疼痛綜合征，臨床上以自發痛、誘發痛、痛覺過敏、痛覺超敏以及疼痛異常為特征。由于其發病機制復雜，尚無特別有效的治療手段，近年來越來越成為疼痛領域研究的熱點。而星形膠質細胞被認為是NP激活的重要靶點，探索其分子機制有可能為臨床疼痛治療提供新的思路。pannexin（PX）通道蛋白是一類縫隙連接蛋白（gap junction，GJ），目前發現存在3種亞型，PX1、PX2、PX3，以PX1表達最多，廣泛存在于全身大部分組織，尤其在神經系統中大量表達。它能連接兩個相鄰細胞，也能形成半通道與細胞外液想通，能夠實現離子及小分子物質在細胞和組織液間的快速交換。有研究發現，星形膠質細胞上PX 半通道能夠通過控制ATP的釋放和調節鈣離子的內流，影響星形膠質細胞的激活狀態［1］。本研究旨在通過建立坐骨神經分支選擇性結扎模型（spared nerve injury，SNI），觀察大鼠脊髓上PX1蛋白的表達變化以及通過鞘內注射GJ阻斷劑甘珀酸（carbenoxolone，CBX），分析其與星形膠質細胞的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑和儀器：PX1 兔多克隆抗體（美國，Sigma）；膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）兔多克隆抗體（北京，中杉金橋）；生物素抗兔二抗（美國，Vector）；辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗（北京，中杉金橋）；CM1900冰凍切片機及激光掃描顯微鏡（德國，Leica）；組織蛋白裂解試劑盒（上海，貝博）；化學發光試劑盒（武漢，博士德）；3，3-二氨基聯苯胺（DAB）顯色液試劑盒（北京，中杉金橋）；CBX 試劑（美國，Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及模型制備 健康SD 雄性大鼠50只，體質量180～200g，由新橋醫院動物實驗中心提供。將50只大鼠分為3組：對照組（WT 組，n＝10）、假手術組（sham 組，n＝10）、SNI組（n＝30）。SNI組：按Decosterd等［2］的方法建立動物模型。大鼠麻醉（2%戊巴比妥鈉50 mg／kg，腹腔注射）后取俯臥位，備皮，消毒后切開大鼠右側大腿后外側，暴露坐骨神經及其分支，遠端結扎并剪斷腓總神經和脛神經，保留腓腸神經，最后逐層縫合肌肉和皮膚。sham 組：大鼠行假手術，在暴露分離坐骨神經后，不作任何處理，直接縫合肌肉和皮膚。WT 組：大鼠不作任何處理。整個手術過程注意動作輕柔，避免牽拉和損傷腓腸神經，術后均肌內注射青霉素預防感染。術后于動物房室溫，單籠飼養。

1.2.2 Western blot法測定脊髓PX1 蛋白表達 SNI組20只大鼠，分別于術后3、5、7、14d（5 只／每個時段）麻醉后處死，分別取其L4～6段脊髓組織；sham、WT 組各5 只大鼠于術后14d麻醉后處死，分別取其L4～6段脊髓組織，加入裂解液冰上勻漿，10 000r／min 離心5 min 后取上清液，核酸濃度儀（Thermo公司）測定蛋白濃度，調定濃度為4μg／uL，加入5×蛋白上樣緩沖液煮沸5min。等量蛋白樣品經過電泳、轉膜、脫脂奶粉封閉后，PX1一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，隔日加入HRP標記的二抗（1∶5 000）37 ℃孵育1h，ECL 化學發光系統顯色。Quantity One軟件分析結果。

1.2.3 大鼠鞘內模型制備 選取SNI組10 只大鼠于建立SNI模型前進行鞘內模型制備，方法參照文獻［3］。大鼠麻醉（2%戊巴比妥鈉50mg／kg，腹腔注射）后取俯臥位，L4～6處切開皮膚，鈍性分離脊柱兩側肌肉，暴露L4～5椎板，剪去部分L5棘突，用5mL注射器針頭刺破黃韌帶同時見清亮液體流出，遂將拉細的硬膜外導管沿相同路徑置入，見大鼠甩尾即置管成功。固定導管，逐層縫合傷口，封閉導管外口。術后第3天導管注入1%利多卡因10μL，有下肢麻痹癥狀的大鼠再按前述方法制備SNI模型。10只大鼠在SNI術后7d分成兩組，5只鞘內注射20μL生理鹽水（SNI＋NS組），另外5只注射20μL 0.5g／L CBX 溶液（SNI＋CBX 組）［4］。

1.2.4 GFAP免疫組織化學染色 術后7d取WT（n＝5）、sham（n＝5）、SNI＋NS（n＝5），SNI＋CBX（n＝5）4組大鼠，麻醉（2%戊巴比妥鈉60 mg／kg，腹腔注射）后剪開胸腔，暴露心臟，從心尖插入灌注針并固定，同時剪開右心耳。首先用0.01 mol PBS液灌注約200mL至肝臟變白后再用4 ℃的4%多聚甲醛灌注約300 mL。小心取出大鼠脊髓組織L4～6段，放置4%多聚甲醛中4 ℃過夜，再放于30%蔗糖溶液中脫水至組織沉底。取出標本，用冰凍切片包埋劑（北京，中山金橋）包埋，制作冰凍冠狀切片（厚度40μm），各標本分別取5 張切片染色。切片經3%H2O2洗脫、Triton X-100 打孔，牛血清封閉后，加GFAP多克隆抗體（1∶100）4 ℃孵育過夜；隔日0.01 mol PBS漂洗后，加入生物素二抗（1∶200）37 ℃孵育2h，再加入鏈霉親和素-生物素復合物（SABC）三抗37 ℃孵育1h，最后滴加DAB液經化學反應后顯色，封片劑封片。每張切片在顯微鏡下觀察，計算每張切片傷側脊髓背角每平方毫米GFAP表達數目，取平均值進行統計分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行分析，計量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內各指標比較用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠脊髓PX1 蛋白表達 與WT、sham 組比較，SNI組術后3dPX1蛋白表達開始升高，術后5、7d一直持續高表達，至14d趨于穩定，仍高于WT、sham 組（P＜0.05）。SNI組術后3、5、7、14d表達差異無統計學意義（P＞0.05）。WT、sham 組表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓PX1蛋白表達

圖2 術后7d各組大鼠脊髓背角GFAP免疫組化圖像

2.2 各組大鼠脊髓背角GFAP表達 術后7dSNI組大鼠脊髓傷側背角GFAP表達較WT、sham 組明顯增強（P＜0.05），SNI＋CBX 組較SNI＋NS組的脊髓背角GFAP表達下調（P＜0.05），但仍高于WT、sham 組（P＜0.05）。sham、WT 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2、3。

圖3 術后7d各組大鼠脊髓背角GFAP表達比較

3 討 論

近年來，隨著對疼痛研究的不斷深入，研究者發現脊髓內的膠質細胞在病理性疼痛的產生和維持中起著重要的作用。在坐骨神經慢性壓迫型模型（CCI）、部分坐骨神經結扎傷模型（PSNL）、L5脊神經冷凍模型中均觀察到脊髓星形膠質細胞和小膠質細胞激活的反應。多種疼痛相關物質可以引起膠質細胞的活化?？s膽囊素和緩激肽可以與星形膠質細胞上的受體結合，激活胞內由Ca2＋介導的信號轉導通路［5］?；罨哪z質細胞可以通過釋放多種神經活性物質ROS、NO、EAAs、ATP等，直接影響神經元的可塑性，使病理性疼痛進一步發展和持續［6］。作為神經免疫細胞，又可以通過合成和釋放多種炎性細胞介質如白細胞介素、TNF-α產生致痛作用［5］。而阻斷脊髓膠質細胞活化則可以抑制或減輕痛敏反應［7］。越來越多的研究表明，調控星形膠質細胞已經成為疼痛研究的一個重要方向。

GJ是連接兩個相鄰細胞的大通道，能夠實現離子及小分子物質在細胞間的快速交換，尤其在神經系統中大量表達。之前的研究表明這些細胞間的縫隙連接通道均由縫隙連接蛋白Connexin（CX）構成，不同于CX 蛋白形成細胞間連接，新發現的PX 作為GJ中的一類新蛋白，主要是以半通道單體的形式存在，調節ATP、Ca2＋等分子直接與細胞外液間的交換［8-9］。其作為細胞信息與外界交換的一種補充，極大地豐富了神經細胞間信息的交換和整合。本研究通過分支選擇性結扎坐骨神經建立NP模型，研究PX1在脊髓中的表達變化。通過Western blot檢測，發現術后3、5、7、14d大鼠脊髓PX1表達量較WT、sham 組明顯上調（P＜0.05）。在術后5～7d，其表達量達到一個峰值，隨后逐漸下降，在14d時趨于平穩。SNI組表達量的明顯增高，提示PX1 可能參與了疼痛的激活和調控。CBX作為目前惟一相對特異非選擇性的GJ阻斷劑，有研究已經證實其可以阻斷縫隙連接通道，導致離子或其他分子交換減少甚至停止。GFAP作為星形膠質細胞的特異性標志物，已經得到大量研究證實。本研究免疫組化中發現，SNI組與其他兩組比較，脊髓背角中GFAP 陽性細胞個數明顯增多（P＜0.05）。在術后7d進行鞘內注射CBX 后，GFAP 陽性細胞個數較未注射的SNI組有明顯的下降（P＜0.05）。由此，可以推測PX1這類GJ可能與星形膠質細胞的表達激活有關。

以前的研究大量集中在CX 上，但是近年來，自從其同源蛋白PX 在2004年被克隆出來后，又成為研究的熱點。PX1蛋白參與了很多重要的病理生理過程。PX1參與了機體免疫應答及炎性反應，巨噬細胞可能由PX1 通道介導IL-1β 釋放［10-11］；紅細胞膜上PX1半通道可介導ATP釋放從而對局部血流進行調節［12］；PX1 還能夠抑制膠質瘤細胞的正常增殖［13］。由于PX 不同于CX 組成的六聚體細胞間通道，只能形成三聚體的半通道。它的功能和CX 相比較類似但又不完全一樣，而這二者誰在疼痛信號的傳遞上起著更為重要的作用，需進一步探究［14］。由于CBX 是非選擇性的GJ阻斷劑，在二者的功能研究上很難以進行區分和鑒別。尋找更好、更特異的GJ阻斷劑，能分別阻斷兩種同源蛋白通道，將為下一步研究提供更好的幫助，同時為疼痛藥物的研發提供方向。

綜上所述，縫隙連接蛋白PX1確實在NP 的發生、發展中起著重要作用。至于PX1半通道如何調控星形膠質細胞，如何進一步整合和傳遞膠質細胞間的信息，還有待進一步的研究。

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