人骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞定向分化的研究分析

劉志剛，熊　敏※，唐　冰，李　鋒，余化龍，曾　云，陳　潔，何　寧，王志勇，韓　珩

(1.湖北醫藥學院附屬東風醫院骨科研究所,湖北 十堰 442000； 2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院骨科,武漢 430030)

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人骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞定向分化的研究分析

劉志剛1，熊敏1※，唐冰1，李鋒2，余化龍1，曾云1，陳潔1，何寧1，王志勇1，韓珩1

(1.湖北醫藥學院附屬東風醫院骨科研究所,湖北 十堰 442000； 2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院骨科,武漢 430030)

摘要：目的探討人骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞定向分化情況。方法取引產胎兒的人骨髓間充質干細胞進行原代細胞培養，誘導培養向成骨細胞分化，誘導后進行形態學觀察，堿性磷酸酶(ALP)染色與生長曲線測定。當人骨髓間充質干細胞培養生長密度為80.0%左右時分為轉染組與對照組，對照組不進行轉染，轉染組常規進行轉染。結果原代細胞生長2 h開始貼壁，培養4 d左右胞體逐漸變得粗大。經成骨誘導后細胞形態由長梭形逐漸變為多邊形，形成細胞結節甚至團塊狀。轉染組的胎兒骨髓間質干細胞和未轉染對照組的生長狀況對比差異無統計學意義(P>0.05)，轉染細胞與未轉染細胞倍增時間分別為(23±4) h和(25±4) h。轉染組在轉染后第3、6、9、12日的ALP活性均明顯高于對照組[(0.12±0.02)%比( 0.10±0.02)%,(0.16±0.02)% 比(0.12±0.02)%,(0.20±0.03)% 比(0.13±0.02)%,(0.23±0.04)% 比(0.14±0.02)%]，差異有統計學意義(P<0.01)。結論胎兒骨髓間充質干細胞在成骨細胞分化轉染的誘導下可促進向成骨細胞進行定向分化，為胎兒間質干細胞分化調控和藥物作用機制研究奠定基礎。

關鍵詞：人骨髓間充質干細胞；成骨細胞；定向分化；地塞米松；堿性磷酸酶

骨髓間充質干細胞屬于成體干細胞，在骨髓中的含量很低，占骨髓內單核細胞總數的1/104～1/105。但是其可在體外分離及大量擴增培養，在不同的誘導劑條件可分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞，也充分證明了骨髓間充質干細胞是多潛能間質干細胞[1-3]。骨髓間充質干細胞因具有獨特的優越性而成為骨組織工程中理想的種子細胞，為骨缺損和骨壞死的修復提供了新方法[4-5]。同時骨髓成骨微環境是一個復雜的三維環境，骨髓微環境不僅為細胞間的相互溝通提供場所，也為成骨的增殖和分化提供必要條件，更重要的是它可以在骨髓間充質干細胞向成骨細胞相互作用的基礎上產生調控功能，從而保證機體骨細胞的穩定狀態[6-7]。骨髓間充質干細胞的轉分化包含兩種形式:一種骨髓間充質干細胞在不同環境下可分別向不同組織細胞分化[8]；另一種是骨髓間充質干細胞向一種組織細胞分化后，在微環境改變的情況下又再向另外的組織細胞轉分化[9]。本研究主要探討人骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞定向分化情況，現報道如下。

1材料與方法

1.1試劑與儀器DMEM培養基、青-鏈霉素溶液、十二烷基磺酸納(美國Gibco公司)、胎牛血清、胰蛋白酶、地塞米松(美國Promega公司)、乙二胺四乙酸、維生素C、β-甘油磷酸、二乙醇胺、D-磷酸硝基酚、二甲基亞砜(美國Sigma公司)。293T細胞株、質粒T antigen和PCI1OA1由本實驗室保存。倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、CO2培養箱(美國Sheldon公司)、超凈工作臺(中國蘇凈集團)、低速冷凍離心機和高速冷凍離心機(美國Gigma公司)。

1.2人骨髓間充質干細胞的分離和培養在產婦知情同意與醫院倫理批準的前提下，取胎齡4個月的引產胎兒，乙醇消毒后取出四肢長骨。無菌環境下剝離肌肉和骨膜，用微量一次性注射器沖洗骨髓腔。以離心半徑10 cm，1000 r/min 離心10 min，棄上清，加入15 mL DMEM培養液重懸細胞。將細胞的濃度調整至107個細胞/mL，重懸后加入裝有3 mL Ficoll淋巴分離液的離心管中，以離心半徑10 cm，2000 r/min 離心30 min。吸出培基和分離液之間的間質干細胞層，再用DMEM培養基洗滌3次(離心半徑10 cm,1000 r/min，5 min)。重懸后將濃度調整至106個細胞/mL，種入25 cm2的塑料培養瓶中，常規在CO2培養箱進行培養與換代。

1.3細胞轉染當人骨髓間充質干細胞培養生長密度為80.0%左右時分為轉染組與對照組，對照組不進行轉染。而轉染組在轉染前1日，按1×106個細胞/mL將293T細胞密度加入不含抗生素的DMEM 10 mL培養基種入10 cm的培養皿中，常規溶解SV40病毒質粒和包裝質粒PCI1OA1和Lipofectamin 2000，混勻后在室溫下孵育5～10 min，形成混合物。將前1日種板的293T細胞培基吸掉，加入3 mL上述混合物，孵育6 h后，加入新鮮培養基，培養48 h后將培養基用4.5 μm的濾膜過濾。然后加入50%合的原代間質干細胞，同時加入800 mg/L的Polybene 5 μL。傳代后加入含0.5 mg/L的嘌呤霉素進行篩選，繼續進行傳代。

1.4成骨誘導分化將轉染細胞的轉染組和未轉染的P4代對照組細胞按1×104個細胞/mL密度接種12孔板，第2日換含誘導劑的培基(10%胎牛血清，5 mmol/L β-甘油磷酸、25 mg/L 維生素C、1 mmol/mL地塞米松)，傳代進行培養。倒置顯微鏡下觀察細胞生長的速度、形態，并進行攝像保存。

1.5細胞生長曲線的測定取生長良好的第3代細胞和轉染后的細胞消化制備單細胞懸液，調整細胞濃度為1×104個細胞/mL接種于6 cm培養皿。常規進行培養，每日取出3個培養皿，胰酶消化后計算每皿細胞數，多次測量取均值。以細胞數對數值為縱軸，培養時間為橫軸，繪制細胞生長曲線。根據Patterson公式計算細胞群體倍增時間[10]。

1.6堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)活性測定取轉染的與未轉染細胞的細胞，用10%胎牛血清洗滌3次，0.04 g/L蛋白酶E消化并收集細胞。然后進行細胞內ALP活性測定，采用分光光度法進行測定，400 nm處測定吸光度，測定3次，取平均值。

2結果

2.1顯微觀察原代細胞生長2 h開始貼壁，初期細胞呈長梭形伸展貼壁，培養4 d左右后胞體逐漸變得粗大，有細長的突起(圖1)。經成骨誘導后，細胞形態由長梭形逐漸變為多邊形，胞核大而清晰，單核或2個左右核仁，形成細胞結節甚至團塊狀(圖2)。

圖1　原代人骨髓間充質干細胞　(HE染色×20)

圖2　誘導劑誘導人骨髓間充質干細胞　(HE染色×20)

2.2細胞轉染效果將0.5 mg/L的嘌呤霉素加入轉染后的胎兒骨髓間質干細胞，轉染組48 h后出現少量死亡細胞，72 h后細胞完全融合。而未轉染細胞的對照組全部死亡。而從繪制的生長曲線可以看出，轉染組的胎兒骨髓間質干細胞和未轉染對照組的生長狀況對比差異無統計學意義(P>0.05)，轉染細胞與未轉染細胞倍增時間分別為(23±4) h和(25±4) h。見圖3。

圖3　未轉染人骨髓間充質干細胞與轉染人骨髓間

2.3兩組ALP活性比較轉染組在轉染后第3、6、9、12日的ALP活性均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1轉染組與對照組轉染后第3、6、9、12日ALP活性比較

組別3d6d9d12d對照組0.10±0.020.12±0.020.13±0.020.14±0.02轉染組0.12±0.020.16±0.020.20±0.030.23±0.04t3.2687.1529.55712.458P<0.01<0.01<0.01<0.01

ALP：堿性磷酸酶; 對照組:不進行轉染

3討論

骨髓間充質干細胞來源于中胚層，具有多向分化潛能，能向成骨細胞、內皮細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、網狀細胞等分化，是目前應用較廣泛的重要種子細胞之一[10-11]。

在體外，建立切實可行的誘導處理分化條件，提高骨髓間充質干細胞向神經元細胞誘導處理的效率，是骨髓間充質干細胞最終應用于臨床治療的基礎工作。但骨髓中骨髓間充質干細胞的含量很低，并隨年齡增加而減少[12]。要利用骨髓間充質干細胞就必須實現其體外分離培養和克隆。骨髓間充質干細胞具有在塑料培養瓶中貼壁生長的特性，同時操作方法簡單、易掌握，是一個較好的分離方法。同時認為在分離骨髓間充質干細胞時選擇Percoll分離液對細胞進行分離較好，用Percoll分離液對大鼠骨髓作梯度離心，除去大部分血細胞，收集單個核細胞；用貼壁法培養除去剩余的非骨髓間充質干細胞，該方法所得細胞純度較高。

通過顯微鏡下觀察發現，胎兒骨髓間質干細胞的形態與文獻報道[13]的成人的骨髓間充質干細胞C的形態一致，初期細胞呈長梭形伸展貼壁，培養4 d左右胞體逐漸變得粗大，有細長的突起。傳代后生長明顯加快，2～7 d為對數生長期，細胞倍增時間為(23±4) h，主要在于胎兒處于發育早期，細胞增殖能力更強。

骨髓間質干細胞的可以自發的向成骨細胞分化，在體外含10%胎牛血清普通培養條件下骨髓間質干細胞還可部分自發地分化成脂肪細胞，不過傳代至5～6代細胞即開始出現老化，增殖緩慢，不能形成骨結節[13]。為此本研究用SV40病毒大、小T片段轉染原代培養的胎兒骨髓間質干細胞，用嘌呤霉素進行篩選，得到的細胞具有更好的活力。骨髓間質干細胞的體外成骨分化很大程度上依賴于誘導條件，如地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C作用于骨髓間質干細胞，在特定的濃度下則是誘導其向成骨細胞分化的基本輔劑。其中地塞米松可以誘導骨髓間質干細胞分化表達骨鈣素，誘導其ALP活性，刺激細胞外膠原間充質的生物合成、鈣的沉積和鈣化結節的形成[14]。而β-甘油磷酸鈉提供磷離子作為ALP作用的底物，誘導和激活ALP。而在維生素C存在時，β-甘油磷酸鈉對ALP的活性增加無明顯作用。只有在β-甘油磷酸鈉時，骨髓間充質干細胞才發生礦化結節的沉積。而地塞米松的存在不僅促進骨髓間充質細胞生長和分化，而且調節成骨細胞分泌胰島素樣生長因子，促進細胞外間充質膠原合成。本研究骨髓間質干細胞經成骨誘導后，細胞形態由長梭形逐漸變為多邊形，胞核大而清晰，單核或2個左右核仁，形成細胞結節甚至團塊狀。轉染組48 h后出現少量死亡細胞，72 h后細胞完全融合。轉染組的胎兒骨髓間質干細胞和未轉染對照組的生長狀況對比差異無統計學意義(P>0.01)，轉染細胞的倍增時間為(25±4) h。

ALP活性增強是成骨細胞分化成熟的重要標志。ALP是成熟成骨細胞的標志酶之一，其主要作用為水解有機磷酸酶，啟動鈣化。其活性的增加反映了成骨細胞成熟的程度增高[15]。本研究結果顯示，轉染組不同時間點的ALP活性均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，表明分離的細胞是骨髓間質干細胞，用SV40病毒基因穩定轉染的細胞形態和成骨特性與未轉染的細胞無明顯差異，多次傳代后仍保持良好的增殖及分化狀態。而未轉染的細胞傳至第5～6代后就逐漸老化，失去增殖和分化的能力。

總之，胎兒間質干細胞系是一種很好的研究細胞增殖、分化調控和藥物作用機制的細胞模型。胎兒骨髓間充質干細胞在地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C的誘導下在體外可向成骨細胞進行定向分化，為以后進一步進行胎兒間質干細胞分化調控和藥物作用機制研究打下了基礎。

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The Basic Research Analysis of Direct Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Osteoblasts in VitroLIUZhi-gang1,XIONGMin1,TANGBing1,LIFeng2,YUHua-long1,ZENGYun1,CHENJie,HENing1,WANGZhi-yong1,HANHeng1.(1.DepartmentofOrthopedicsInstitute,AffiliatedDongfengHospitalofHubeiMedicalCollege,Shiyan442000,China; 2.DepartmentofOrthopedics,TongjiHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China)

Abstract:ObjectiveTo discuss human bone marrow mesenchymal stem cells differentiation into osteoblasts in vitro.MethodsHuman bone marrow mesenchymal stem cells of induced labor fetus were taken for primary culture to induce osteoblast differentiation,the morphology was observed,the alkaline phosphatase(ALP) staining and the growth curve were determined.When human bone marrow mesenchymal stem cell culture growth density was about 80.0%,they were divided into two groups:transfection group and control group,the control group was not transfected,the transfection group was givenconventional transfection.ResultsThe primary cell were adherent growth after 2 h and showed stretch fusiform adherent cells after cultured for 4 days.The cell body gradually became thick and showed elongated protrusions.After inducing,the cells showed morphology.The cells growth conditions between the transfected fetal bone marrow mesenchymal stem cells and the untransfected cells showed no significant difference(P>0.05).The doubling time of the transfected cells and non-transfected cells were (23±4) h and (25±4) h respectively.The ALP activity of the transfection group was significantly higher at different times [(0.12±0.02)% vs ( 0.10±0.02)%,(0.16±0.02)% vs (0.12±0.02)%,(0.20±0.03)% vs (0.13±0.02)%,(0.23±0.04)% vs (0.14±0.02)%] (P<0.01).ConclusionHuman bone marrow mesenchymal stem cells directly differentiated into osteoblasts in vitro under induction,which can be the basis for further fetal interstitial stem cell differentiation regulation and study on the drug action mechanisms.

Key words:Human mesenchymal stem cells; Osteoblasts; Directed differentiation; Dexamethasone; Alkaline phosphatase

收稿日期：2015-02-11修回日期：2015-06-11編輯：伊姍

基金項目：十堰市科學技術研究與開發項目計劃(14Y50)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.056

中圖分類號：R468-2

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)18-3412-03