海藻膠低聚寡糖的酶法制備純化技術及保水理化性質分析*

黃 菊 丁 晨 謝 超① 裘曉華 俞群娣 李桂芬

(1. 浙江省海產品健康危害因素關鍵技術研究重點實驗室 浙江海洋學院食品與醫藥學院 舟山 316022;2. 浙江國際海運學院 舟山 316002)

當前世界經濟已經進入資源環境瓶頸期, 陸域資源、能源和空間的壓力與日俱增。開發海洋資源、發展藍色經濟相繼成為世界各國實現可持續發展的戰略選擇。我國海洋資源豐富, 海藻加工及其高值化利用成為我國海洋資源綜合利用的重要領域。其中,海洋生物功能資源的開發利用正迅速成為新的支柱產業不斷發展。尤其以海藻多糖及其降解產物——特異性海藻低聚糖為原料的海洋藥源和食藥同用的保健食品原料的開發和功能研究近年來受到廣泛關注,而利用海洋微生物代謝酶降解海藻生產海藻低聚糖已成為繼化學降解后更為有效的研究手段。海藻膠是一種源自海藻類植物細胞壁的水溶性酸性多糖, 其降解產物——海藻低聚糖因其特殊的化學特性和生物活性, 其功能評價和開發研究得到不斷深入, 活性及藥用價值研究已經成為新的熱點(紀明侯, 1997)。海藻膠寡糖、低聚糖具有多種生物功能, 在藥物、能源、食品等各個方面都用途廣泛, 且與褐藻膠相比,具有易溶于水、無抗原性, 以及在宿主體內具有較弱的積累效應等優點(紀明侯等, 1962; 張晨, 1992)。但目前寡糖、低聚糖的價格十分昂貴, 在規?；瘧蒙鲜艿胶艽蟮南拗? 主要原因是對寡糖、低聚糖的制備技術和作用機制的研究尚不夠深入, 因此研制或改進新的生產技術, 生產工藝, 降低成本, 提高產率是擴大其應用范圍的關鍵問題(趙齊川等, 1991)。經過對前人的研究總結和文獻查新, 在酶解法制備方面,作者選擇了海藻膠裂解酶做探索性研究, 該酶對海藻膠裂解速度快, 產率高、產物質量均一, 且操作安全無公害, 到目前為止, 國內外雖對酶降解制備低聚糖的研究已有報道, 但對酶裂解反應過程中的工藝條件及參數沒有明確的定義和確定最優值; 而在膜分離提取方面, 國內外對海藻膠寡糖的分離、分析方法的研究文獻報道尚未多見(李金寶等, 2003)。因此,對海藻膠低聚糖的分離、分析檢測方法的研究能夠有助于進一步理解海藻膠的結構, 并制定海藻膠低聚糖的分離制備標準。本研究將通過一系列正交實驗對海藻膠寡糖進行酶降解, 和采用層析柱分離膜對1000—8000Da聚合度的海藻寡糖進行分離提取, 確定最佳工藝條件。進而為提高海藻膠寡糖及低聚糖的制備條件和生產工藝起到一定的指導作用, 以期為海藻膠寡糖和低聚糖的利用開發提供理論依據(陳正霖等, 1989)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

儀器和設備: TZL-98型恒溫振蕩器(浙江省寧波市醫療器械廠); Milli-Q 超純水系統(Millipore,Milford), AXIMACFR型基質輔助激光解析電離質譜儀(MALDI-TOF-MS, 島津); 旋轉蒸發儀 RE64-B(上海榮威); Heto公司L-000型真空冷凍干燥; 集熱式恒溫磁力攪拌器(北京長城科技); LTQ-XL型質譜儀(ThermoFisher)。

材料和試劑: 海藻酸鈉、褐藻膠裂解酶(青島百成海洋生物資源有限公司)、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸、磷酸氫二鉀、硫酸鎂等(國藥化學試劑有限公司)。層析柱硅膠(粒度: 200-300目)青島海洋化工廠; 強陰離子交換柱(Dowex, 1×4400目); 凝膠柱(SephadexG-25); 正丁醇、醋酸、甲酸為分析純; 甲醇為fisher色譜純。

1.2 實驗內容及方法

1.2.1 溫度對褐藻膠裂解酶降解效果的影響 取pH 7.0、1% (W/V)的海藻膠溶液 10mL, 加入粗酶液2mL, 反應體積為 12mL?；旌弦悍謩e于 20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、60°C水浴保溫5h后, 立即在沸水浴處理15min滅活, 用滅活的粗酶液作為對照, 保溫處理10min后在265nm處測定吸光度, 做三次平行試驗(張書利等, 2006)。

1.2.2 pH對褐藻膠裂解酶降解效果的影響 取1%(W/V)的海藻膠溶液, 調節 pH 分別為 4.5、5.0、5.5、6.0、6.6、7.0、7.5、8.0、8.5。取不同 pH 的海藻膠溶液 10mL, 加入粗酶液 2mL, 反應體積為 12mL?；旌弦涸谧钸m溫度下, 保溫水解 5h 后, 用滅活的粗酶液作為對照, 在 265nm 處測定降解液的吸光度。

1.2.3 酶解時間對褐藻膠裂解酶降解效果的影響取1% (W/V)的海藻膠溶液, 調節pH為最適反應pH,取海藻膠溶液 10mL, 加入粗酶液 2mL, 反應體積為12mL?；旌弦涸谧钸mpH條件下, 分別保溫水解 1、3、5、7、9h 后, 用滅活的粗酶液作為對照, 在265nm處測定吸光度(Davidson et al, 1976)。

1.2.4 加酶量對褐藻膠裂解酶降解效果的影響取1%(W/V)的海藻膠溶液, 加入裂解酶分別占總體積比為 5%、15%、25%、35%、45%、反應體積為20mL,調節最適 pH, 用滅活的粗酶液作為對照, 其余操作相同, 在265nm處測定吸光度(Sawbe et al, 1992)。

1.2.5 底物濃度對褐藻膠裂解酶降解效果的影響取濃度(W/V)分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的海藻膠溶液 10mL, 加入粗酶液 2mL, 再分別加入占總體積比為 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%的裂解酶溶液, 反應體積為20mL, 調節最適 pH, 用滅活的粗酶液作為對照, 在 265nm處測定海藻膠降解液的吸光度(王斌等, 2007)。

1.2.6 強陰離子交換柱分離 將海藻膠低聚糖樣品溶于水, 調節最適 pH, 過強陰離子交換層析柱(Dorex, 2×4400 目), 依次用蒸餾水, 0.5、0.7、1.0、2.0、3.0mol/L的NH4Ac洗脫, 分別隔管吸取收集液200μL于試管中。然后加入100μL 50%苯酚與2mL濃硫酸,搖勻, 室溫靜置 30min, 測定 368nm處吸光值, 對吸光值做分離曲線, 得到兩個組分, 然后用TLC分析各組分含量(Kitamikado et al, 1990)。

1.2.7 硅膠柱分離 將 200mg海藻膠低聚糖溶于10mL蒸餾水中, 加入5g硅膠, 攪勻, 于烘箱中35°C烘干, 自然洗脫, 每約 10mL收集一管, 至洗脫液中無糖檢出為止。按照TLC的檢測結果合并相應組分,濃縮蒸發, 上樣。然后將各組分溶于水, 進行Malde-Tof-Ms分析。重復過柱, 富集各組分后, 用上述方法將各組分進行二次分離, 進行 TLC分析和質譜分析(馮蕾等, 2006)。

2 結果與討論

2.1 酶解法對海藻膠低聚寡糖制備的優化研究

2.1.1 溫度對褐藻膠裂解酶降解效果的影響 溫度對海藻膠裂解酶降解效果的影響結果如圖1所示。隨著水解溫度的升高, 酶解液在 265nm處的吸光度逐漸增大, 在45°C時, 達到最大值。之后再隨著溫度的升高, 吸光度開始逐漸下降。這是因為, 溫度會影響酶的活性, 在一定范圍內酶的活性會隨著溫度的升高而增強, 但過了最適溫度后, 酶的活性會隨著溫度的升高而降低甚至失活不再改變, 使催化活性降低。結果表明45°C是海藻膠酶解的最適溫度。

圖1 溫度對海藻膠酶解產率的影響Fig.1 Temperature effect on enzymatic hydrolysis yield from alginate gel

2.1.2 pH對海藻膠裂解酶水解效果的影響 pH對海藻膠裂解酶水解效果的影響的結果如圖 2所示,隨著pH的增加, 在pH小于7.0時, OD265緩慢增加,在 pH 7.0處達到最大值, 當 pH超過7.0時, OD265開始迅速下降。因為pH的大小改變了溶液中氫離子的濃度, 影響了酶作用的環境, 從而對酶活性產生了影響, 結果表明海藻膠酶解的最佳pH為7.0。

圖2 pH對海藻膠水解效果的影響Fig.2 Effects of pH on hydrolysis of alginate gel

2.1.3 時間對海藻膠裂解酶降解效果的影響 由圖 3中可以看出, 在降解過程中, 隨著降解時間的增加, OD265也隨之增加, 當降解 6h 后, 吸光度開始緩慢下降。因為隨著反應時間的增加, 底物的轉化率在不斷增加, 使得產物濃度越來越大, 阻礙了反應的進行(萬小飛等, 2008)。研究表明海藻膠酶解的最佳時間為6h 。

2.1.4 加酶量對海藻膠裂解酶降解效果的影響從圖4中可以看出, 在海藻膠裂解酶降解海藻膠的過程中, 隨著酶含量的提高, OD265也逐漸增大。在酶用量達45%時, 降解產物在 265nm 處的吸光度達到最大值。之后, 隨著海藻膠裂解酶含量的繼續增加,OD265保持不變甚至有所下降, 研究表明海藻膠酶解的最適酶添加量為45%。

圖3 時間對海藻膠水解效果的影響Fig.3 Temporal effect on alginate gel hydrolysis

圖4 加酶量對海藻膠水解效果的影響Fig.4 Effect of enzyme addition on alginate gel hydrolysis

圖5 底物濃度對海藻膠水解效果的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on alginate gel hydrolysis

2.1.5 底物濃度對海藻膠裂解酶降解效果的影響由圖 5中可以看出, 當海藻膠濃度在一定范圍內增加時, 酶解產物OD265也逐漸增加。當海藻膠質量分數達到 0.8%(W/V)時, 海藻膠酶解產物在 265nm 處的吸光度達到最大, 之后隨著底物濃度的增加, 酶解效果開始逐漸下降。因為, 當底物質量分數較低時,反應速度與底物質量分數呈正比, 隨著底物濃度的再增加, 底物逐漸被酶飽和, 反應速率不再上升, 反而有所下降。研究表明: 海藻膠酶解的最適底物濃度為 0.8%(W/V)。

圖6 強陰離子交換柱分離后兩個組分對應的MALDI-TOF-MS圖譜Fig.6 MALDI-TOF-MS analysis of two fractions

圖7 海藻膠低聚糖經硅膠柱的分離圖Fig.7 Separation of alginate oligosaccharides by silica gel column

2.2 海藻膠低聚寡糖的提取分級優化研究

2.2.1 膜類型對海藻膠低聚糖超濾截留液 DE值的影響

(一) 強陰離子交換層析柱分離 通過圖 6可以看出, 用強陰離子交換層析柱(Dorex, 2X4400)對樣品進行分離所得的四個組分都為混合物。因此, 用強陰離子交換柱層析分離, 樣品中各聚合度低聚寡糖均未得到分離。

(二) 硅膠柱分離 一次分離: 將樣品按照TLC的檢測結果共分為四個組分, 再將這四個組分取等體積做Malde-Tof-Ms分析, 結果如下圖所示。從圖7結果顯示, 各組分并未得到完全分離, 但是各組分樣品以一個聚合度為主。為了進一步驗證分離的情況, 取四個組分樣品各 200mL, 稀釋 100倍, 進行Malde-Tof-Ms分析。從Malde-Tof-Ms圖譜(圖8)可以看出, 在硅膠柱層析分離所得的四個組分中, 組分一是以分子量為1000—2000Da海藻膠低聚寡糖為主的組分, 含有少量的 2000—4000Da的低聚寡糖; 組分二是以分子量為2000—4000Da海藻膠低聚寡糖為主的組分, 含有少量的 4000—6000Da低聚寡糖; 組分三是以分子量為4000—6000Da海藻膠低聚寡糖為主的組分, 也含有2000—4000Da和6000—8000Da的低聚寡糖; 組分四是以分子量為 6000—8000Da海藻膠低聚寡糖為主的組分, 同時也含有少量4000—6000Da的低聚寡糖。因此樣品中的低聚部分已被分為兩種寡糖或三種寡糖的混合物。

二次分離: 為了進一步得到純品, 將第一次分離的各個組分用硅膠柱進行第二次分離。Malde-Tof-Ms分析結果如下圖所示(李悅明等, 2010)。

結果顯示, 二次分離各聚合度寡糖基本得到分離(如圖 9所示)。為了進一步驗證分離的情況, 取四個組分樣品各 2 0 0 m L, 稀釋 1 0 0倍, 進行Malde-Tof-Ms分析, 從 Malde-Tof-Ms圖譜(圖 10)可以看出, 在硅膠柱二次分離所得的四個組分中, 組分一以 1000—2000Da海藻膠低聚寡糖為主, 含有極少量的 2000—4000Da的低聚寡糖; 組分二為2000—4000Da的海藻膠低聚寡糖, 幾乎不含其它聚合度的寡糖; 組分三以分子量為 4000—6000Da海藻膠低聚寡糖為主, 幾乎不含其它聚合度的寡糖; 組分四以分子量為6000—8000Da的海藻膠低聚寡糖為主,幾乎不含其它聚合度的寡糖。因此1000—8000Da分子量的海藻膠低聚寡糖基本得到分離, 其中4000—6000Da、6000—8000Da的低聚寡糖純度相對比較大, 所以采用硅膠柱層析分離海藻膠低聚寡糖。

圖8 硅膠柱一次分離后各組分對應的MALDI-TOF-MS圖譜Fig.8 MALDI-TOF-MS spectra of all components after first separation by silica column

圖9 海藻膠低聚糖經硅膠柱二次分離的TLC圖Fig.9 TLC (Thin Layer Chromatography) diagram of secondary separation of alginate oligosaccharides by silica gel column

2.2.2 四種海藻膠低聚糖超濾截留液DE值隨時間的變化 在膜分離過程中, 于不同時間段取截留液進行DE值的測定, 隨著分離的進行, 四種截留液 DE 值隨時間的變化如圖11所示。由圖11可知, 隨著超濾膜分離的不斷進行, 截留液的 DE 值均呈下降趨勢。DE值越低代表產品分離程度越高。四組超濾截留液的DE值還可下降到比較低的程度, 均可獲得 DE 值在 20以下的產品。 當在起始的 2h分離時間內, 4000—6000Da和 6000—8000Da的兩種海藻膠低聚糖在超濾過程中, DE值要明顯好于其它兩組, 且下降趨勢較平緩, 當到達過濾的最終時間段時, 6000—8000Da和4000—6000Da的DE值相近且都略低于另外兩組。且在超濾膜過濾 4h后, 6000—8000Da和 4000—6000Da兩組截留液海藻膠低聚寡糖的 DE值下降都不再明顯,說明此時過濾已基本終止, 所以, 超濾膜分離的最適時間應為4h。且這一過程, 操作可控, 安全無雜, 可根據實際所需自主調控, 直到產品達到所需的要求(康平等,2007)。由此可見, 通過對酶法制備的海藻膠低聚寡糖的超濾分離, 可以得到精確控制DE值的產品。

2.2.3 不同分子量海藻膠低聚糖超濾截留液DE值隨溫度的變化 如圖 12所示, 隨著超濾膜分離溫度的不斷升高, 截留液 DE值均呈上升趨勢, 說明還原糖沒有被過濾出去, 滲透通量呈不斷下降趨勢。運行初期, 滲透通量下降較慢, 但隨著運行溫度的增長,超濾膜發生變性, 粘度增加, 流動性能變差, 膜表面開始產生濃差極化, 此時膜通量的衰減加快。當溫度達到 30°C時, 膜表面會因截留的大分子多糖不斷積累而形成凝膠層, 膜通量開始迅速衰減, 如果持續運行將會引起膜的嚴重污染和損壞(蔡俊鵬等, 2006)。由圖 12可見, 在MWCO 8000Da超濾分離運行的溫度應控制在27°C左右為最宜, 方能得到較適DE值的海藻膠低聚寡糖產品。

圖10 硅膠柱二次分離后各組分對應的MALDI-TOF-MS圖譜Fig.10 MALDI-TOF-MS spectra of all components after secondary separation by silica gel column

圖11 四種海藻膠低聚糖超濾截留液DE值隨時間的變化Fig.11 Temporal changes in DE (dextrose equivalent) value for four liquid alginate oligosaccharides in the rejected liquid after ultrafiltration

圖12 四種海藻膠低聚糖超濾截留液DE值隨溫度的變化Fig.12 Changes with temperature in DE value for four liquid alginate oligosaccharides in the rejected liquid after ultrafiltration

2.3 不同分子量海藻膠低聚寡糖的溶解、吸水、穩定性比較

2.3.1 溶解性分析比較 不同分子量海藻膠低聚寡糖的水溶性測定結果如表 1所示, 分級前后海藻膠低聚寡糖的水溶性存在較大的差異。在25°C冷水中, 分子量 6000—8000Da的低聚寡糖水溶性最高,達到 93.01%, 而 1000—2000Da的最差, 而在 75°C熱水中, 各海藻膠低聚寡糖的水溶性都比較高, 尤其是分子量為6000—8000Da的, 水溶性達到了99.66%。因為升溫能破壞晶形, 因此其它海藻膠低聚糖在冷、熱水中的水溶性差異較大, 水溶性隨溫度的升高而大大提高(包華芳等, 2010), 其中, 1000—2000Da的低聚寡糖水溶性增幅最大, 但在熱水中的溶解性卻依然最小, 可能是與其分子間聚合度較低有關。

表1 不同分子量海藻膠低聚糖的水溶性Tab.1 Water solubility of alginate oligosaccharides in different molecular weights

2.3.2 吸水性分析比較 不同相對濕度條件下不同分子量海藻膠低聚寡糖樣品的吸水性如圖 13 所示。由圖13可以看出, 隨著環境濕度的增加, 海藻膠低聚寡糖的吸水性都呈現增加的趨勢。相對濕度在85%以下時, 隨著相對濕度的增加, 海藻膠低聚寡糖的吸水性緩慢上升, 分級前后海藻膠低聚寡糖的吸水性差異較小。隨著相對濕度的繼續增加, 不同分子量海藻膠低聚寡糖的吸水性大幅度上升, 當相對濕度為 98%時, 各分子量海藻膠低聚寡糖的吸水強弱順序為: 6000—8000Da＞4000—6000Da＞2000—4000Da＞1000—2000Da, 其水分含量分別為46.36%、41.83%、40.32%、32.39%?？梢钥闯? 各種海藻膠低聚寡糖在吸水性上的差異, 在高濕度條件下才體現出來(劉巖等, 2001), 經過分級后, 1000—2000Da的吸水性最弱,6000—8000Da分子量的海藻膠低聚寡糖最強。

2.3.3 凍融穩定性分析比較 不同分子量海藻膠低聚寡糖的凍融穩定性測定結果如表 2 所示。凍融穩定性代表了物質的持水能力, 用析水率表示。由表2 可以看到, 凍融 4 次, 1000—2000Da、2000—4000Da和 4000—6000Da都有水析出, 析水率隨凍融次數的增加呈上升趨勢, 且 1000—2000Da的最大。6000—8000Da的沒有水析出, 凍融穩定性最好, 因為形成堅硬的凍膠, 解凍后基本無水析出(Higgins et al, 1996)?？梢? 分子量為 6000—8000Da 的海藻膠低聚寡糖的凍融穩定性最好。

圖13 不同分子量海藻膠低聚寡糖的吸水性Fig.13 Water absorption by alginate oligosaccharides in different molecular weights

表2 不同分子量海藻膠低聚糖的析水率Tab.2 Syneresis rate (in %) of alginate oligosaccharides in different molecular weights

在對海藻膠低聚寡糖的溶解性、吸水性、穩定性上述3種保水指標的測量中發現, 四種不同分子量海藻膠低聚寡糖中, 6000—8000Da的低聚寡糖無論是在溶解性、吸水性還是在穩定性方面均最好?？赡苁且驗? 分子量越大, 分子間聚合程度越高, 結晶性越強, 相互作用性也越強, 且含有更多的水溶性大分子物質造成的(Jeanmougin et al, 1998)?？梢? 隨著分子量增大, 海藻膠低聚寡糖的持水性, 凍融穩定性都顯著提高, 而 6000—8000Da分子量的海藻膠低聚糖因其更加穩定且致密的網狀聚合結構, 以及更多的親水基團, 大大增強了其吸附和持水能力, 因而使其吸水性、穩定性更好。大分子海藻膠低聚寡糖的制備與分級篩選, 為后期其對魷魚、蝦及肉制品的抗凍保水應用提供了理論基礎和原料保障。

3 結論

在利用酶解法制備海藻膠低聚糖時, 當溫度45°C, pH 7.0, 時間 6h, 酶添加量 45%, 底物濃度0.8%時, 海藻膠降解成低聚糖的產率最高, 達到75%左右; 采用硅膠柱超濾膜分離提取不同分子量海藻膠低聚糖時, 溫度控制在 27°C, 時間在 4h以內時,分離提取率最高, 達到70%左右。且海藻膠低聚糖分子量多為6000—8000 Da范圍內。該方法成本低, 工藝簡單, 產品較均一, 無污染, 是工業制備海藻膠低聚糖發展方向之一。

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