長牡蠣(Crassostrea gigas)三個選育群體完全雙列雜交后代生長性狀分析*

王衛軍 李 琪 楊建敏① 李 彬 張榮良

(1. 中國海洋大學 海水養殖教育部重點實驗室 青島 266003;

2. 山東省海洋資源與環境研究院 山東省海洋生態修復重點實驗室 煙臺 264006)

長牡蠣(Crassostrea gigas)又稱太平洋牡蠣, 自然分布于西太平洋海域, 是一種廣溫、廣鹽性貝類, 具有環境適應強、生長快、風味鮮美、營養豐富等優點, 是世界上養殖范圍最廣、產量最高的經濟貝類。長牡蠣在我國沿海均有分布, 但以遼寧、山東、江蘇較多, 年產量達到數百萬噸, 2013年我國牡蠣產量421.9萬噸, 占海水養殖總產量的24.26%(農業部漁業漁政管理局, 2014)。

近幾年, 隨著長牡蠣養殖規模的擴大, 產量大幅度提高, 但其品質卻在下降, 種質也出現退化。表現為出肉率低、形狀不規則、肉質差的特點, 養殖單位和廣大消費者迫切需要產量高、品質好的長牡蠣新品種。因此, 應用傳統的定向選育和雜交育種方法, 進行長牡蠣遺傳改良、培育名優新品種, 是推動我國長牡蠣養殖品種的良種化, 使我國由牡蠣養殖大國向牡蠣養殖強國轉變的重要技術手段。我國的牡蠣良種選育工作開展較晚, 但發展迅速。目前, 利用群體繼代選育方法, 已經在我國培育出了第一個長牡蠣快速生長新品種“海大 1號”。在國外, 美國農業部的WRAC(Western Regional Aquaculture Center)主要研究雜交育種是否具有提高牡蠣產量的潛力。研究表明,通過建立配套系或者近交系, 進行雜交育種是提高長牡蠣生長和存活性狀的重要途徑(Britten, 1996;Hedgecock et al, 2007)。

有關牡蠣雜交的研究在 20世紀 80年代即有報道。Mallet等(1983)對未經選育的美洲牡蠣進行了群體間雜交, 發現雜交子代在總重和存活率方面存在雜種優勢。Hedgecock等(1995)驗證了長牡蠣近交系間雜交獲得的子代的雜合度與生長和存活成正相關。Hedgecock等(2007)利用近交系進行完全雙列雜交,通過分析配合力和回交效應, 篩選出了最佳的雜交組合。宋盛亮等(2011)利用中國、日本和韓國三個地理群體的長牡蠣F2代選育系進行了雜交子代的早期生長發育研究, 部分雜交組合在生長和存活方面表現出雜種優勢。目前, 有關牡蠣雜交育種方面的研究主要集中在利用牡蠣種間雜交評估生長優勢(張躍環等, 2012, 2014; 鄭懷平等, 2012; Huo et al, 2013)和對不同長牡蠣選育群體進行種內雜交, 分析幼蟲階段生長性狀和存活性狀的雜種優勢(宋盛亮等, 2011; 孔令鋒等, 2013)等方面, 未見關于利用多代選育系進行種內雜交分析成體階段生長性狀的報道。

作者于2007年從日本宮城、韓國釜山引進野生群體以及采用中國乳山養殖群體, 建立快速生長定向選育系, 至 2010年這三個選育系已選育至第四(F4)代。群體選育的代數越高, 群體間的遺傳分化越大,產生雜種優勢的可能性就越大(Sheridan, 1997)。本實驗以中國、日本和韓國長牡蠣F4代選育群體為材料,采用完全雙列雜交, 通過構建家系的方式, 建立選育系間雜交和自交群體, 分析各個交配組合的生長性能, 剖分生長性狀的加性(一般配合力)和非加性(特殊配合力)遺傳組分, 為運用雜交育種, 培育長牡蠣優良新品種, 提高長牡蠣生長性狀指標提供技術參數。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2007—2010年期間, 在山東省文登市水產綜合育苗試驗基地對2007年采集的中國(C)、日本(J)和韓國(K)群體進行了四代定向選育。本實驗用長牡蠣親貝分別取自2010年構建的中國、日本和韓國選育群體。二齡貝時, 在每個選育群體中選取殼形規則, 濕重較大的個體作為親貝。殼高48.96—105.92 mm, 濕重21.10—73.80 g。實驗于2012年6月在山東省蓬萊海益苗業有限公司萊州分公司進行。

1.2 實驗設計

采用3×3完全雙列雜交的方式, 構建選育組合共9組, 其中自交組合3個: 中♂×中♀(C♂C♀), 日♂×日♀(J♂J♀), 韓♂×韓♀(K♂K♀); 正反交組合 6 個:C♂J♀, C♂K♀, J♂C♀, J♂K♀, K♂C♀, K♂J♀。實驗采用家系構建的方式, 每個交配組合構建 3-5個家系,共計33個家系(表1)。

表1 交配表及每個交配組合中的家系數量Tab.1 Mating schedule and number of families of each group

1.3 實驗方法

1.3.1 人工授精孵化與幼蟲培育 從 C、J、K選育群體中分別挑選性腺發育良好的雌、雄個體, 要求親本殼形規則、貝殼完整。實驗采用人工解剖受精的方式, 將每個雌性個體的卵子解剖后放置于 10 L小桶中, 在22°C海水的小桶中促熟30 min。等卵子熟化后解剖雄性個體, 將精卵混合, 采用單對單受精模式建立家系。孵化密度控制在30—50個/ml, 溫度控制在22—23°C, 受精后約22 h, 發育到D形幼蟲。

為保證每個交配組合中各家系幼蟲的數量一致,將每個交配組合家系的幼蟲分別選優至100 L聚乙烯桶中培育, 初始D形幼蟲密度10個/mL。每個家系取相同數量的 D形幼蟲, 按照正反交和自交組合的交配設計將相應的家系進行混合?；旌线^程中, 保證各個實驗組的養殖密度一致, 最終密度控制在5個/mL,在200L的聚乙烯桶中進行培育。

當幼蟲平均殼高在 200μm 左右時, 將密度調整至 1—2個/mL。水溫控制在 22—23°C, 持續充氣。幼蟲培育早期, 每天換水一次, 換水量 1/3—1/2; 幼蟲培育后期, 每天換水兩次, 換水量 1, 每周清底一次, 所用海水經過砂濾處理。餌料以等邊金藻(Isochrysis galbana)和小球藻(Cholorella pyrenoidosa)為主, 后期輔助投喂扁藻(Platymonas helgolandica),投餌量根據幼蟲的消化腺顏色情況和水中殘餌情況確定。各實驗組投餌、換水、充氣等操作一致。所用試驗器具都在淡水中浸泡10min以上, 然后曬干, 殺死殘留幼蟲, 避免各試驗組之間相互污染。

1.3.2 稚貝及成體培育 當 20%左右的幼蟲出現眼點, 投放櫛孔扇貝殼附著基, 保證每片附著基上附著5—10個稚貝。稚貝繼續在室內培養10天后暫養于沉淀池, 確認自然海區無野生長牡蠣浮游幼蟲污染后, 于2012年9月, 將各實驗組放置于煙臺崆峒島(KTD)進行籠式浮筏懸掛養成。

1.3.3 數據測量 由于長牡蠣是一種固著型貝類,殼高小于4cm時, 僅測量殼高和殼長數據; 當殼高大于 4cm時, 將固著在扇貝殼附著基上的稚貝撬為單體牡蠣, 測量殼高、殼長、殼寬和濕重等生長性狀指標。2012年12月(180日齡)、2013年5月(330日齡)和2013年9月(450日齡)測量長牡蠣成體的生長數據,測量時清除長牡蠣表面的附著物及野生小牡蠣, 每個交配組合測量100個左右個體。

1.4 統計分析

1.4.1 生長性狀數據分析 利用SPSS16.0軟件進行多組數據的單向方差分析(One-way ANOVA), 獲得各個交配組合在各階段各生長指標的平均值、標準差和標準誤, 以 P＜0.05作為差異顯著水平, 對其平均值進行LSD, Turkey多重比較; 利用SPSS16.0軟件中的相關性分析模塊, 對不同生長階段生長指標進行皮爾遜相關性分析(丁國盛等, 2006)。

1.4.2 配合力計算 利用ASReml-R軟件, 采用混合線性模型和約束極大似然法估算生長性狀的配合力, 其線性混合模型(親本模型)為:

式中, yij系第i個父本群體與第j個母本群體雜交的生長性狀觀測值, μ為生長性狀的總體均數, Mi為母本效應, Dj為父本效應, MDij為雜交組合效應, eij為隨機誤差效應。其中μ作為固定效應, 其它因子作為隨機效應(林元震等, 2014)。

1.4.3 雜種優勢效能

式中, CV指的是雜交組合表型值(Cross value), MPV指中親值(Mid-parent value), L指的是兩親本自交系表型性狀平均值的絕對值(Griffing, 1990; Hedgecock et al, 2007)。效能值大于1.0作為具有雜種優勢的標準(Griffing, 1990)。

2 結果

2.1 各個交配組合在不同生長階段生長性狀的統計性描述

以交配組合為單位, 分別統計長牡蠣各組合在不同生長階段殼高、殼長、殼寬和濕重各生長指標的平均值, 并進行顯著性檢驗, 統計結果見表2和圖1、圖2。

180日齡, 各交配組合平均殼高范圍為 19.87—37.86 mm, 平均殼長為14.41—26.43 mm。雜交組合C♂K♀的平均殼高值最大, 是自交組合K♂K♀的1.91倍, 兩組間差異顯著(P＜0.05)。330日齡, 各交配組合平均殼高、殼長、殼寬和濕重的變化范圍依次是為:30.26—46.77 mm, 22.02—32.36 mm, 10.18—15.61 mm和 3.33—9.18 g。雜交組合 J♂C♀各生長指標值均為最大(殼長除外, 為第二高值), 其生長優勢明顯, 自交組合K♂K♀生長最慢。雜交組合J♂C♀的平均濕重是自交組合K♂K♀的2.76倍, 且差異顯著(P＜0.05)。450日齡, 殼高、殼長、殼寬和濕重等生長指標最大值的組合各不相同。其中, K♂J♀殼高平均值最大,C♂C♀殼長平均值最大, C♂K♀殼寬平均值最大,K♂C♀濕重平均值最大。但是這四個組合在平均殼高、殼長和濕重方面差異性不顯著(P＞0.05)。以產量(濕重)為主要指標, 雜交組合 K♂C♀生長優勢明顯,自交組合K♂K♀生長最慢。

圖1 不同生長階段各交配組合殼高的比較Fig.1 Comparison in shell height at different growth stages of each group

圖2 不同生長階段各交配組合濕重的比較Fig.2 Comparison in wet weight at different growth stages of each group

2.2 配合力分析

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鑒于在長牡蠣商業化生產過程中主要關注個體大小(殼高)和產量高低(濕重), 故配合力分析時只對長牡蠣的殼高和濕重這兩個生長性狀指標進行分析。本實驗設計采用劉來福等(1979)第一種方法, 即可以同時產生包括親本自交子代和正、反交子代材料, 共有(n2, n=3)9個組合。因此, 通過本實驗可以同時估算父本和母本一般配合力(加性遺傳)效應和子代特殊配合力(非加性遺傳)效應。

中國F4代選育群體的父母本在三個生長階段多數具有較高的一般配合力效應值, 而韓國 F4代選育群體父母本一般配合力效應值較低, 均具為非正值(表 3)。不同交配組合在不同生長階段表現出不同的特殊配合力效應值(表4)。180日齡, 殼高平均值最大的雜交組合為C♂K♀, 是最大GCA效應值(gC♂=2.21,gK♀=0.00)和最大 SCA 效應值(sC♂K♀=4.95)的組合。與之不同的是, 在330日齡, 殼高和濕重平均值最大的雜交組合均為 J♂C♀, 但是其父本 GCA效應值并不是最大值。在450日齡時, 殼高平均值最大的雜交組合為 K♂J♀, 其父母本的 GCA 效應值(gK♂=0.00,gJ♀=0.06)均不是最大值, 但是其 SCA 效應值(sK♂J♀=3.33)最大; 濕重平均值最大的雜交組合為K♂C♀, 其父母本的 GCA 效應值(gK♂=0.00, gC♀=0.39)均是最大值, 其 SCA 效應值(sK♂C♀=2.87)接近于最大值 2.99?？梢? 一般配合力(加性效應)和特殊配合力(非加性效應)在不同生長階段發揮著不同的作用。

表3 不同群體主要生長性狀的父母本一般配合力效應值Tab.3 General combing ability in main growth traits of sire and dam in different groups

表4 不同交配組合主要生長性狀的特殊配合力效應值Tab.4 Specific combing ability in main growth traits of different mating groups

2.3 雜種優勢效能

在不同生長階段, 多數(19/30)雜交組合的殼高和濕重指標表現出雜種優勢(表 5), 符合 Griffing(1956)數量遺傳學意義上的雜種優勢(hp＞1.0)。雜交組合C♂J♀在330日齡和450日齡的殼高指標表現出雜種劣勢(hp＜0), 但是其反交組合 J♂C♀的殼高和濕重指標表現出雜種優勢(180日齡除外)。330日齡時,C♂J♀的殼高比中親值41.07 mm小2.13 mm。而J♂C♀殼高比中親值大5.70 mm。日本F4代選育群體和韓國F4代選育群體不論是正交(J♂K♀)還是反交(K♂J♀)組合的效能值均大于 1.0, 均表現出不同程度的雜種優勢。450日齡時, K♂J♀的殼高效能值是J♂K♀的3.52倍。實驗結果表明, 正反交組合存在明顯的正反交效應。

表5 各雜交組合主要生長性狀參數的雜種優勢效能值Tab.5 Heterosis potence of main growth traits in hybridized groups

2.4 不同生長階段的相關性分析

假如能從長牡蠣早期生長階段預測商品規格收獲時期的生長情況, 就可以節省大量養殖試驗成本和加快雜交育種的進程。對180日齡、330日齡和450日齡長牡蠣的殼高和濕重進行了兩兩相關性分析, 并進行了顯著性檢驗(P=0.01), 結果發現, 180日齡、330日齡和450日齡殼高的相關性均高于0.92(表6), 且達到顯著性水平(P＜0.01)。330日齡和 450日齡濕重也成正相關,相關系數為0.895, 且達到顯著水平(P=0.001)。

表6 不同生長階段的相關性分析結果Tab.6 Results of correlation analysis on traits of different growth stages

3 討論

3.1 自交組合與雜交組合生長性狀的差異

在本實驗中大多數雜交組合表現出生長優勢,但在不同生長階段個別自交組合也表現出好的生長性能(如: 180日齡和330日齡自交組合C♂C♀), 然而自交組合 K♂K♀在不同生長階段生長性能表現均為最差。雜種優勢的利用一般是在親本種群純合子基因型頻率盡可能增加, 個體間差異盡可能減小的基礎上進行(Sheridan, 1997)。在本實驗中, 雜交子代的表型值并不都比最優親本的表型值高, 主要有兩個方面的原因: 一是在對親本群體進行繼代選育過程中,為了有效防止近交衰退的發生, 在獲得高的遺傳進展的同時, 通過增加有效繁殖親本的數量和平衡有效親本精卵的貢獻率, 最大程度的避免了三個繼代選育群體的遺傳多樣性丟失(王慶志, 2011); 二是雖然本實驗用材料已經進行了四代繼代選育, 但是從表型值的變異系數看, 各個自交系的變異系數仍較大。結合各自交系的生長性能, 實驗結果說明中國F4代群體還有較大的選育空間。

3.2 配合力與雜種優勢效能值

不同品系/種群間雜交能否獲得好的效果, 其遺傳基礎是基因的加性效應。遺傳力主要是由加性效應決定, 一般配合力也是由基因的加性效應控制(盛志廉等, 1999)。有學者對長牡蠣生長性狀遺傳參數估計,結果顯示幼體階段殼高和殼長為中高遺傳力(王慶志等, 2009), 成體階段殼高和濕重的遺傳力分別為0.35和0.27(王慶志等, 2012)。中國F4代選育群體殼高和濕重的父母本一般配合力(加性效應值)大多為正值,而韓國F4代選育群體殼高和濕重父母本一般配合力均為負值, 說明中國 F4代選育群體作為親本時可將性狀優勢穩定傳遞給雜交子代。

雜交子代的表型值會隨著一般配合力的增加而增大(Langdon et al, 2003), 但非加性因素有時卻是影響產量的最大因素, 即表型值高的雜交子代常會具有高的特殊配合力效應值和較低的一般配合力效應值(Hedgecock et al, 2007)。在水產動物中, 皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)、海灣扇貝(Argopectens irradias)的生長性狀和凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的存活性狀均存在較高的非加性效應(Zheng et al, 2006; Deng et al, 2010; 王浩等, 2013),因此, 可以通過特殊配合力分析指導雜交育種(鄧岳文, 2005)。

在本試驗數據分析過程中, 雜種優勢效能值計算方法不同于傳統動物學家的定義, 我們所采用的公式更能體現雜種子代是否超過了最優的親本值(Hedgecock et al, 2007)。與SGA相似, 雜交優勢的遺傳學基礎也主要是非加性效應(顯性效應和上位效應)。鄧岳文(2005)認為遺傳力低、近交時衰退嚴重的性狀, 在進行雜交育種時, 雜種優勢(非加性效應)較大。

在雜交育種過程中, 是應該主要參考 GCA效應值、SCA效應值還是雜交效能值？Hedgecock等(2007)認為, 選擇近交親本系和進行一般配合力與特殊配合力效應值評估應同時進行。雜交育種的目的是獲得具有優良生長性能的雜交子代, 并對其進行商業推廣。但是在大規模商業化推廣之前, 首先要測試雜交子代的生長性能, 在此過程中通過對數據的分析, 獲得親本的GCA效應值、雜交子代的SCA效應值和雜種優勢效能值。由于GCA效應值屬于加性遺傳范疇,可以保證親本的優良性狀穩定地遺傳給雜交子代,故 GCA效應值可以指導親本的選擇。雜交子代的SCA效應值和雜種優勢效能值都屬于非加性效應范疇, 故可以在試驗范圍內篩選 SCA效應值和雜種優勢效能值高的雜交組合進行大規模商業化推廣。

3.3 不同生長階段的相關性分析

通過相關性分析, 結果表明不同發育階段存在正相關, 而且相關系數均大于0.89。按照傳統的雜交育種進程, 在長牡蠣雜交育種過程中, 需要對多個品系或者種群進行雜交測試, 這需要大量的養殖空間,加之養到商品規格需要的時間長, 這在時間和空間上制約了雜交育種的開展。但是本實驗發現不同生長階段的相關系數高, 可以大幅縮短育種過程中的測試時間和養殖成本, 可加速優良雜交組合的商業化推廣進程。

4 結論

綜上所述, 雜交組合 C♂K♀、J♂C♀和 K♂J♀分別在180日齡、360日齡和450日齡表現出較大的生長優勢, 而自交組合 K♂K♀在各個生長階段均表現出生長劣勢。中國F4代選育群體的GCA效應值高,適合作為雜交候選父母本; K♂J♀、K♂C♀、J♂C♀的SCA效應值和雜種優勢效能均較高, 可進行商業化推廣。不同生長階段相關系數大于0.89, 可實現早期生長對商品期長牡蠣最佳雜交組合的預測, 這將大幅縮短育種過程中的測試時間和養殖成本, 可加速優良雜交組合的商業化推廣進程。

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