尼索地平控釋貼劑在自發性高血壓大鼠體內的藥動學-藥效學結合模型的建立Δ

聶 陽，許良葵，李 博，朱俊訪，陳新穎（1.廣東省中藥研究所，廣州 51050；.廣東食品藥品職業學院，廣州 51050；3.中山大學工學院，廣州 510006）

尼索地平為二氫吡啶類鈣離子拮抗藥，作用效果是硝苯地平的4～10 倍，具有抗絞痛、抗心肌缺血和降血壓等作用。我國臨床應用其普通片、膠囊、軟膠囊、緩釋片和緩釋膠囊等劑型，美國已有尼索地平控釋片上市，但均為口服消化道給藥，存在肝首關效應明顯、生物利用度低（≤5%）、消化道不良反應嚴重等問題[1-3]。針對尼索地平口服給藥的局限，筆者為開發其經皮給藥制劑，前期研究了尼索地平醇質體作為透皮給藥載體，具有較高的藥物經皮滲透速率和經皮滲透量[4]；應用新型骨架型基質作為控釋體系，制備了尼索地平控釋貼劑（NCRP）。本研究采用微透析技術采集血樣，以NCRP給藥自發性高血壓大鼠（SHR），建立藥物濃度-藥理效應之間的關系，得到藥動學-藥效學（PK-PD）結合模型的主要參數，為NCRP的新藥研究提供依據。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；微透析系統，包括150 型動物保溫墊、402 型微量注射泵、85 型低溫樣品收集器（瑞士CMA公司）；RM6240BD型多道生理信號采集處理系統（成都儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

NCRP（廣東省中藥研究所自制，批號：20140311，規格：每貼5 mg）；非洛地平對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130452-200902，純度：98%）；尼索地平片（山東力諾科峰制藥有限公司，批號：110512，規格：每片5 mg）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

2 方法與結果

2.1 分組與預處理

取SHR12 只，隨機分為貼劑（NCRP）組和片劑（尼索地平片）組，每組6 只，12 h 光照和12 h 黑暗環境下適應性飼養數天，自由飲食飲水。貼劑組大鼠給藥前2 d，先用剃刀剃除背部粗毛，再涂8%硫化鋇溶液脫去背部細毛，生理鹽水洗凈，作為給藥部位。

2.2 微透析探針的植入

每只SHR 用20%烏拉坦按體質量（0.5 ml/100 g）ip 麻醉，用柔軟紗布條固定SHR 四肢和頭，以保溫墊維持體溫在37.5 ℃左右；將微透析探針（分子截留值5 000 Da，膜長30 mm）用穿刺針引導植入SHR 腹部皮下中，使探針在皮下表淺可見，以灌流液（格林氏液）8 μl/min 流速灌流0.5 h，再以2μl/min流速平衡0.5 h，并用手術線固定探針，用于收集血漿微透析液。

2.3 給藥與血樣采集

兩組SHR給藥前1 d，禁食不禁水。貼劑組每只SHR背部相同位置貼敷NCRP 1 貼，透氣膠布纏繞固定，給藥后1、2、3、4、6、8、10、12、16、24、30、36 h收集血漿微透析液，冷凍保存；同時測定SHR 給藥前后不同時間點的血壓（尾動脈收縮壓）、記錄心率。

片劑組每只SHR ig尼索地平片1片，于給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24、36 h 收集血漿微透析液，冷凍保存；同時測定血壓、心率。

2.4 血漿微透析液中尼索地平濃度的測定方法

采用高效液相色譜法測定各組SHR血漿微透析液中尼索地平的濃度。精密吸取透析樣品20 μl，加入10 ng/ml 非洛地平溶液（內標）5 μl，渦旋混勻，吸取20 μl注入液相色譜儀進行測定。色譜條件：色譜柱為Zorbax XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水-三乙胺（72∶28∶0.1，以冰醋酸調pH值至5.0），流速為1.0 ml/min；檢測波長為237 nm；柱溫為40 ℃；進樣量為20 μl。以尼索地平與內標的峰面積之比（y）對尼索地平質量濃度（x）作線性回歸，得回歸方程為y＝0.295x+3.27×10－5（r＝0.999 2）。結果，尼索地平的線性范圍為0.20～10.0 ng/ml，最低檢測限為0.20 ng/ml（信噪比為3）；方法回收率、絕對回收率分別為（97.4±4.2）%、（93.7±6.1）%，RSD分別為2.23%、3.52%（n＝6）。

2.5 藥動學考察

取“2.3”項下兩種SHR 不同時間點的血漿微透析液，按“2.4”項下方法測定其中尼索地平的血藥濃度，采用WinNonlin 5.3 軟件處理，計算藥動學參數，采用WinNonlin 中的PK/PD Link 程序模塊進行擬合PK-PD 結合模型。SHR 體內尼索地平的藥-時曲線見圖1，藥動學參數見表1。

圖1 SHR體內尼索地平的藥-時曲線Fig 1 The drug-time curves of nisoldipine in SHR

表1 尼索地平在SHR體內的藥動學參數（，n＝6）Tab 1 Pharmacokinetic parameters of nisoldipine in SHR（，n＝6）

表1 尼索地平在SHR體內的藥動學參數（，n＝6）Tab 1 Pharmacokinetic parameters of nisoldipine in SHR（，n＝6）

注：與片劑組比較，＊P＜0.05Note：vs.tablets group，＊P＜0.05

由圖1 可見，與片劑組比較，貼劑組SHR 的血藥濃度“峰谷”波動程度減小，能長時間維持較高濃度，釋藥達峰時間和持效時間延長，控釋效果良好。由表1 可知，尼索地平的藥動學過程選擇權重系數為1/c2，描述為開放的二室模型較為合理。藥動學參數經t檢驗，與片劑組比較，貼劑組的tmax延長、cmax降低、AUC0-36h和AUC0-∞提高、MRT延長，差異有統計學意義（P＜0.05），亦說明NCRP的控釋效果比尼索地平片好。

2.6 藥效學考察

2.6.1 心率 記錄“2.3”項下兩種SHR不同時間點的心電圖，按公式計算心率[心率＝60/1 個心動周期的持續時間（s）]，以各時間點的心率與取樣時間繪制心率-時間曲線，結果見圖2。

由圖2可見，給藥后，兩組SHR的心率都有所加快，片劑組SHR心率快速升高，心率升高約2 h時達到峰值，約6 h時心率加快不再明顯；貼劑組SHR 心率緩慢升高，心率升高約4 h 時達到峰值，此后心率升高逐漸減弱，約16 h時不再明顯。對比血藥濃度變化過程與心率變化過程，可看出心率藥效滯后0.5～1 h，存在滯后現象。

圖2 兩組SHR的心率-時間曲線Fig 2 The heart rate-time curves of SHR in two groups

2.6.2 血壓 記錄“2.3”項下兩種SHR不同時間點的血壓（尾動脈收縮壓），以各時間點的血壓和取樣時間繪制血壓-時間曲線，結果見圖3（注：1 mm Hg＝0.133 kPa）。

圖3 兩組SHR的收縮壓-時間曲線Fig 3 The systolic blood pressure-time curves of SHR in two groups

由圖3可見，給藥后，兩組的收縮壓都有所降低，片劑組收縮壓快速下降，血壓降低約2.5 h 時達到峰值，約6 h 時血壓降低不明顯；貼劑組收縮壓下降緩慢，血壓降低約6 h達到峰值，此后血壓降低逐漸減弱，約16 h 時不再明顯。對比血藥濃度變化過程與血壓變化過程，可看出降壓藥效滯后1～3 h，也存在滯后現象。

2.7 NCRP的PK-PD模型擬合

以二室模型與效應室模型建立NCRP的PK-PD模型。各房室藥物的量用微分方程式表示，公式：dDe/dt＝K1eD1－KeoDe，式中D1、De為中央室和效應室藥量；K1e為藥物從中央室轉運到效應室的平衡速率常數；Keo為效應室的消除速率常數。將NCRP 的藥效（心率、收縮壓）-血藥濃度轉化為藥物效應（E）-效應室藥物濃度（ce）間的關系，兩者之間的關系用Sigmoid-Emax模型擬合，公式：E＝Emaxceγ/（ceγ+EC50γ），式中Emax為藥物的最大效應；ce為藥物濃度；EC50為引起半數最大效應的效應室藥物濃度；γ為陡度參數，反映曲線的形狀[5-6]。分別將采樣時間t、各采樣時間的血藥濃度c及心率或收縮壓數據輸入WinNonlin 5.3 軟件，采用PK-PD Link 程序模塊進行PK-PD 結合模型擬合，得NCRP的PK-PD結合模型的參數見表2。

3 討論

微透析技術適用于小分子活性物質的分析，具有活體取樣、動態觀察、定量分析、對組織損傷小、可連續監測且易實現自動化等優點，特別適合于深部組織和重要器官的活體生化研究[7-8]。本實驗采用微透析采集血樣、高效液相色譜技術測定大鼠皮下血液中尼索地平的藥物濃度，較好地反映了尼索地平在大鼠經皮給藥的藥動學特征。

表2 NCRP的PK-PD結合模型的參數（，n＝6）Tab 2 Parameters of PK-PD model of NCRP（，n＝6）

表2 NCRP的PK-PD結合模型的參數（，n＝6）Tab 2 Parameters of PK-PD model of NCRP（，n＝6）

尼索地平能增加心輸出量，提高心臟冠狀竇氧飽和度，增加冠脈流量及減少耗氧量等[9]。藥動學研究結果顯示，與片劑口服給藥比較，尼索地平以貼劑透皮給藥的血藥濃度波動程度減小，能維持長時間高濃度；經皮給藥后藥物從效應室消除的速度要慢于口服給藥，效應維持的時間較長。藥效學研究結果顯示，貼劑組的心率升高緩慢、降血壓變化更為平緩。以上表明貼劑中藥物發揮了控釋作用。

本文建立的NCRP PK-PD 模型顯示藥物在大鼠體內分布比較快，心率、血壓的效應峰值均滯后于血藥濃度峰值，說明藥物是逐漸分布到效應室中的，導致其效應峰值的出現慢于血藥濃度峰值。Keo反映藥物在中央室和效應室之間的平衡速率，也反映了藥物滯后效應的強弱[10]。貼劑組心率、血壓藥效指標的Keo并不相同，說明兩個藥效指標可能隸屬于不同的效應室，藥物從中央室分布到各個藥效學指標所對應的效應室的時間不同。PK-PD 模型解決了尼索地平透皮給藥與心率、血壓效應的預測問題，將為后續研究提供參考。

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