腸炎沙門氏菌非編碼小RNA STnc640 對菌毛相關基因的調控分析

孟 霞，孟憲臣，朱春紅，王 亨，王金秋，倪 杰，王勇祥，朱國強

(1.揚州大學 獸醫學院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009；3.江蘇省家禽科學研究所 家禽遺傳育種重點實驗室，江蘇 揚州 225125；4.北京農業職業學院 畜牧獸醫系，北京 102442)

腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis，SE)是一種重要的人畜共患病原菌，可以長期定居于家禽的腸道和生殖道，并長時間排毒[1-2]，呈現隱性感染，同時也可表現為有臨床癥狀的致死疾病，嚴重影響養殖業的經濟效益。SE 致病性取決于其宿主特異性腸吸附菌毛(黏附素)介導的定居能力和毒素產生能力，黏附素通過與宿主腸上皮細胞表面受體結合，使SE定居于特定段小腸并局灶性大量增殖，同時介導宿主細胞信號傳遞和適當途徑的毒素傳遞，從而引發機體一系列的病理過程[3]。因此，黏附是SE 感染機體至關重要的第一步。SE 基因組包含13 個菌毛相關的操縱子以及外膜蛋白ompD 基因等，其編碼蛋白均不同程度地參與了黏附和定植宿主小腸上皮細胞的過程[4-5]。

細菌非編碼小RNA(Small non-coding RNA，sRNA)為一類在基因組中被轉錄但不編碼蛋白的RNA 分子[6]。絕大多數sRNA 的主要作用方式是通過堿基的不完全互補配對與靶標mRNA 結合在5' 或3' 非翻譯區(UTR)，調控靶標mRNA 的翻譯、降解或穩定性[7]，其具有調節速度快，消耗能量少，可在轉錄后水平調控等優點[6-7]。STnc640 是鼠傷寒沙門氏菌中的一種sRNA[8]，目前STnc640 的功能尚未見報道。作者前期研究發現SE 中也存在STnc640 基因，靶標基因預測表明STnc640 可能調控菌毛相關基因的表達。因此，本研究通過構建stnc640 缺失突變株及相應的回補株，進一步分析STnc640 在SE 主要菌毛亞單位基因表達中的作用，為STnc640 在菌毛基因以及毒力調控方面的研究提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 菌株及質粒 SE 國內標準株CMCC(B)50336、大腸桿菌DH5α 及表達質粒pBR322 均由本實驗室保存；Red 同源重組[9-10]所需質粒包括：含有溫度敏感復制子的同源重組輔助質粒pKD46，該質粒經阿拉伯糖誘導后可表達Gam、Beta 和Exo 3 個λ 噬菌體重組酶；pKD3 為重組轉化子提供篩選標志，含氯霉素抗性(Cmr)基因和FRT 位點(FLP 重組酶識別位點)；pCP20 為含氨芐青霉素抗性(Ampr)和Cmr基因的溫度敏感型質粒，42 ℃誘導下可表達FLP 重組酶，以消除FRT 位點間的Cm 基因。以上質粒均由美國賓夕法尼亞大學獸醫學院微生物實驗室饋贈。

1.2 主要試劑 pMD18-T 載體、Taq DNA 聚合酶、Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser、熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒、DNA Marker DL2000均購自TaKaRa 公司；DNA 凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；MicroPulser Electroporator 購 自Bio-Rad 公司。

1.3 Red 同源重組構建stnc640 突變株

1.3.1 引物設計及同源重組打靶DNA 片段的制備和純化 根據GenBank 中登錄的SE P125109 株stnc640 基因上下游序列設計引物P1/P2，用于克隆SE 標準株50336 中stnc640 的DNA 序列。根據 測序結果設計用于Red 同源重組的引物P3/P4，其中5'端下劃線處的序列與stnc640 兩側的序列同源，3' 端無下劃線的序列與質粒pKD3 的Cmr基因的序列互補。引物P1/P2 也用于基因缺失菌株的鑒定。引物均由上?；瞪锛夹g公司合成(表1)。以質粒pKD3 為模板，P3/P4 為引物，PCR 擴增同源重組打靶DNA 片段。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測回收后測定濃度。

1.3.2 Red 重組功能的誘導和第一次同源重組 將pKD46 質粒熱擊轉化至SE50336 株感受態細胞，利用Ampr(50 μg/L)LB 培養基篩選單個菌落并鑒定，鑒定正確的陽性克隆經30 mmol/L L-阿拉伯糖誘導，充分表達Exo、Bet 和Gam 蛋白后制備成電轉化感受態細胞，然后將1.3.1 中制備的同源重組打靶DNA 片段電轉化入其中，利用CmrLB 平板篩選單菌落，然后分別進行Ampr和Cmr檢測，挑選對Amp 敏感而Cmr的克隆，重組菌命名為SE50336△stnc640::cat。

表1 PCR 引物序列和擴增片段大小Table 1 The primers for the PCR and the sizes of PCR products

1.3.3 FLP 位點專一性重組 將質粒pCP20 轉化至重組菌SE50336△stnc640::cat 的感受態細胞中，轉化產物涂布于含Ampr和Cmr的LB 平板上，30 ℃培養篩選陽性轉化子，然后將獲得的陽性轉化子轉接至無抗性的LB 中，42 ℃培養過夜，37 ℃劃線培養分離單菌落，并對其進行Ampr和Cmr檢測，篩選對兩種抗生素均敏感的突變株SE50336△stnc640，進一步對其進行PCR 和測序鑒定。

1.4 回補株的構建 以親本株SE50336 基因組DNA 為模板，采用引物P5/P6 擴增stnc640，經測序驗證后克隆至表達載體pBR322 中，將鑒定正確的重組質粒pBR-stnc640 電轉化至突變株SE50336△stnc640 中，構建回補株50336△stnc640/p stnc640。

1.5 不同生長時期STnc640 表達水平檢測 根據SE STnc640 序列和解旋酶gyrA 內參基因序列設計qRT-PCR 引物(表1)。將親本株50336 接種于普通LB 液體培養基中培養至菌液OD600nm分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和3.0 時，收集菌液提取RNA，以gyrA 的表達量為內參，進行qRT-PCR 檢測STnc640在細菌不同生長時期的表達水平。

1.6 黏附相關基因表達量的檢測 根據發表的SE主要菌毛亞單 位sefA、safA、stbA、sthA、csgA、csgD、pegA 和外膜蛋白ompD 基因設計qRT-PCR 引物(表1)。將親本株SE50336、突變株SE50336△stnc640 及回補株SE50336 △stnc640/p stnc640 培養至OD600nm值為2.5 時，收集菌液，提取RNA 進行qRT-PCR，檢測3 個菌株中菌毛相關基因和外膜蛋白ompD 基因的表達情況。采用2-△△Ct法計算突變株與親本株的差異，試驗重復3 次。

2 結果

2.1 stnc 640 基因缺失菌株的構建及鑒定 以pKD3 質粒為模板，P3/P4 為引物PCR 擴增同源重組打靶DNA 片段，結果顯示目的片段約為1.1 kb，與預期大小一致(圖1)，該產物兩端為同源臂，與stnc640 基因上下游序列同源，中間為Cmr基因片段。將PCR 產物轉入含質粒pKD46 的SE50336 株中，通過CmrLB 固體培養基篩選陽性克隆，采用引物P1/P2 進行PCR 鑒定，結果顯示，以親本株和stnc640 一次重組菌為模板的PCR 產物分別約為800 bp和1 500 bp(圖1)，表明獲得具有Cmr的重組子50336△stnc640::cat。

圖1 stnc640 缺失突變株的構建Fig.1 Construction of stnc640 deletion mutant

2.2 缺失菌株中抗藥基因的敲除及鑒定 將質粒pCP20 轉化于重組子50336△stnc640::cat 中，誘導重組酶的表達，篩選對Amp 和Cm 均敏感的菌株，采用引物P1/P2 對篩選的單菌落進行PCR 擴增并經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示缺失了抗性基因的重組菌PCR 產物約為400 bp(圖1)，測序結果顯示缺失株Cmr基因丟失，僅在同源序列區中留下FRT 位點，表明SE50336△stnc640 缺失突變株構建正確。

2.3 回補質粒和回補株的構建 以SE50336 基因組DNA 為模板，PCR 擴增stnc640 基因，將PCR 產物克隆于表達載體pBR322 中，構建回補質粒pBRstnc640，并對其進行雙酶切鑒定(圖2)。將鑒定正確的回補質粒pBR-stnc640 轉化于缺失突變株50336△stnc640 中，構建回補菌株50336△stnc640/p stnc640。

圖2 回補質粒pBR-stnc640 的雙酶切鑒定Fig.2 Enzyme digestion analysis of pBR322-stnc640

2.4 不同生長時期STnc640 表達水平檢測 利用qRT-PCR 檢測親本株SE50336 內STnc640 在細菌不同生長時期的表達量。結果顯示，隨著時間的延長，STnc640 表達量逐漸升高，并且在穩定期(OD600nm=2.5)表達量最高(圖3)，為對數早期(OD600nm=0.5)表達量的16.5 倍，因此選擇該時期進行STnc640 功能研究。

圖3 親本株50336 STnc640 在不同生長時期的表達情況Fig.3 Expression characteristics of STnc640 at different growth phase in the parental strains

2.5 Stnc640 調控黏附相關因子的表達 利用qRT-PCR 方法對親本株SE50336、50336△stnc640 和50336 △stnc640/p stnc640 中主要菌毛亞單位sefA、safA、stbA、sthA、csgA、csgD 和pegA 以及外膜蛋白基因ompD 的表達水平進行檢測。結果顯示，相比親本株，50336△stnc640 中菌毛亞單位sefA、csgD和外膜蛋白ompD 的表達均顯著下調，mRNA 水平分別為親本株的27.1 %、54 %和37 %，而50336△stnc640/p stnc640 中以上各基因的表達均得到恢復。其余基因無明顯變化(圖4)。

圖4 50336、50336△stnc640 和50336△stnc640/p stnc640 菌株中黏附相關基因的mRNA 水平Fig.4 The adhesion related genes mRNAs levels of 50336,50336△stnc640 and 50336△stnc640/p stnc640 strains

3 討論

本研究克隆了SE50336 菌株的stnc640 基因，構建了stnc640 基因缺失突變株50336△stnc640 和回補株50336△stnc640/p stnc640，分析了STnc640 在細菌生長不同時期的表達情況以及該sRNA 對黏附相關因子的調控情況。結果顯示，STnc640 在穩定期后期表達量較高，因此選擇該時期細菌，利用qRT-PCR 檢測了親本株、突變株和回補株主要菌毛亞單位sefA、safA、stbA、sthA、csgA、csgD、pegA和外膜蛋白ompD 的表達情況。結果顯示，相比親本株，50336△stnc640 中菌毛亞單位sefA、csgD 和外膜蛋白ompD 均表現下調，mRNA 水平分別為親本株的27.1 %、54 %和37 %，其余基因無明顯變化，表明STnc640 可以增強sefA、csgD 和ompD 的表達。sefA 是SEF14 菌毛主要亞單位基因，主要分布于D 血清型沙門氏菌中[11]，該基因與SE 毒力相關，sefA 基因的缺失導致細菌對豬空腸上皮細胞系IPEC-J2 的侵襲力和在鼠腹腔巨噬細胞內的存活力增強[12]。CsgD 基因與沙門氏菌在雞腸道內定植有關[13]。OmpD 與沙門氏菌黏附有關[5]。因此，STnc640 可能與沙門氏菌毒力調控相關，其能否調控沙門氏菌對宿主細胞的黏附和毒力，調控機制如何，有待于進一步的研究。

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