基于組培快繁技術的白及種子萌發和幼苗形態觀察

崔瑞勤　陳科力　徐雷

摘要：為掌握白及實生苗培育過程中的生長發育特點，采用種子組培快繁技術育苗，并對該過程進行動態觀察。在1/2MS+1.0 mg/L NAA培養基中進行種子萌發及叢生芽誘導，7 d后種子膨大成為淡黃色球狀體，21 d后種子突破種皮開始萌發，30 d后開始形成原球莖，40 d后原球莖進一步膨大、顏色逐漸轉綠，部分誘導出愈傷組織，2個月后原球莖基部出現絨毛狀，愈傷組織分化大量叢生芽。叢生芽在1/2MS+1.0 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭+ 1.0 mg/L GA3培養基中進行生根誘導培養，約40 d即可培養出3～5條幼根，此后白及幼苗快速生長，即可進行煉苗移栽。

關鍵詞：白及；種子；組培快繁技術；萌發；幼苗形態；觀察

中圖分類號： S567.23+9.04文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0238-03

收稿日期：2014-04-24

基金項目：國家扶持中藥材生產建設項目。

作者簡介：崔瑞勤（1991—），女，碩士研究生，從事中藥資源及其品質研究。E-mail：18995629089@163.com。

通信作者：徐雷，博士研究生，講師，從事中藥資源及其品質研究。E-mail：wuhanxulei@163.com。白及[Bletilla striata （Thunb.） Reichb. f.]為蘭科白及屬多年生草本植物，是我國的野生資源，主要分布區域北起江蘇、河南，南至臺灣，東起浙江，西至西藏東南部。貴州的東部、西部、南部，廣西的西北、西南山區是野生白及資源的集中分布地及藥材產出中心[1]。當前，貴州、云南、廣西、安徽、浙江、江西、湖北、四川等地均有白及人工栽培，以貴州、安徽、廣西三地栽培量大質優[2]。白及干燥塊莖可供藥用，具收斂止血、消腫生肌的功效，用于咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等癥[3]。白及在我國具有悠久的藥用歷史，始載于《神農本草經》，距今已有2 000多年歷史，是我國民間的傳統中藥，現代研究表明白及主要活性成分為聯芐類、二氫菲，并含聯菲類、其他含菲化合物以及甾類、萜類、酯類、醚類等化合物，具有止血、抗菌、抗腫瘤、促進傷口愈合、促進血管內皮細胞黏附生長以及保護黏膜等藥理作用[4-5]。

白及不僅具有較高的藥用價值，同時還具有較強的觀賞性，也是我國現代醫藥工業和化妝品工業的重要原材料，由于白及應用廣泛，近年來市場需求量不斷增大，在繁殖受限、人工栽培量不足的背景下，其野生資源遭到大量采挖，伴隨供需矛盾的不斷凸顯，白及的價格逐年攀升。目前我國白及資源十分短缺，大量地肆意采挖致使白及野生資源急劇減少，自然生境遭到嚴重破壞，由于其瀕危稀缺，被國家列為重點保護的野生藥用植物之一。

當前白及大規模人工栽培顯得尤為迫切，盡管白及生長過程中能大量產生種子，但種子極細小、質輕且構造簡單無胚乳，不具備自然萌發所需的足夠養分，自然條件下與相適應的真菌共生，由真菌提供其營養才有可能發芽且萌發率較低，所以采用種子繁殖培育實生苗進行栽培較困難。目前，白及栽培主要采用塊莖分離繁殖的方式，大量消耗經濟部位用于繁殖，繁殖系數低，難以適應規?；N植的需要，不能滿足市場需求[6]。同時，由于營養繁殖的后代源至母株的營養體的個體發育并非基于遺傳意義上的重新開始，而是母體生長的延續，所以這種單一繁殖方式長期使用必然引起品種退化，導致產量下降、品質變劣、病蟲害加重、適應性變差等諸多問題。所以，生產中適當采用種子繁殖尤為必要。

采用無菌播種方式進行白及種子組培快繁以獲得實生苗，在培養基中配制白及種子萌發所需的全部養分，種子萌發率高，而且通常1枚白及蒴果中種子數量高達數十萬，所以繁殖系數極大，而且以種子進行繁殖有利于引種馴化以及優良品種選育。所以，本試驗采用組織培養技術培育白及實生苗，對白及種子的萌發、叢生芽的誘導、生根定植、移栽等環節展開跟蹤觀察，以期為白及大規模種子組培快繁育苗積累生產基礎。

1材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

1.1.1材料白及果實采自于湖北神農本草中藥飲片有限公司中藥材GAP示范園，經湖北中醫藥大學藥學院陳科力教授鑒定為蘭科植物白及的成熟蒴果。

1.1.2儀器HP1500GS-B智能人工氣候培養箱（湖北省武漢瑞華儀器設備有限責任公司）；HVE-50高壓蒸汽滅菌器（日本株式會社平山制作所）；BSC1360ⅡA2生物安全柜（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）

1.1.3試劑瓊脂粉（BR，國藥集團化學試劑有限公司）；MS培養基（BR，美國BIOSHARP公司）；NaClO溶液（AR，西隴化工股份有限公司）；赤霉酸（上海滬江生化有限公司）；1-萘乙酸（天津博迪化工股份有限公司）；蔗糖（AR，天津市北方天醫化學試劑廠）。

1.2方法

1.2.1果實預處理將白及未開裂成熟蒴果用流水洗凈，在超凈臺上分別用75%乙醇溶液表面消毒1 min，8% NaClO溶液消毒10 min，再用無菌水反復沖洗4～6次，然后縱向剖開蒴果，用鑷子夾取蒴果外殼，將粉末狀的種子輕輕抖落到培養基表面[7]。

1.2.2培養基制備種子萌發培養基：1/2 MS+1.0 mg/L NAA；生根誘導培養基：1/2 MS+1.0 mg/L NAA+2.0g/L活性炭+1.0 mg/L GA3，培養基配制后于121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.2.3培養條件培養溫度為（25±1） ℃，光照度2 000～2 500 lx，光-暗周期12 h-12 h。

1.2.4無菌播種在無菌條件下將白及蒴果縱向剖開，用鑷子夾取蒴果外殼，將種子輕輕抖落到萌發培養基上，由于每枚蒴果中所含種子數量高達數十萬，因此盡量控制培養基表面種子密度，使其均勻散布（圖1）。endprint

2結果與分析

2.1叢生芽的誘導

白及種子播種于培養基表面后開始吸水膨脹，7 d后種子明顯變大，顏色變淺，成為淡黃色的球狀體或紡錘體（圖2-a）；接種21 d后種子突破種皮開始萌發（圖2-b）；30 d 后開始形成淡黃色原球莖，呈球狀（圖2-c）；40 d后原球莖進一步膨大顏色逐漸轉綠，少數原球莖頂部出現幼葉，有的原球莖誘導出愈傷組織（圖2-d）；2個月后原球莖基部出現絨毛狀，愈傷組織分化出芽（圖2-e），長出1～2 cm的綠葉，獲得大量叢生芽（圖2-f），少數形成小的幼苗。在白及種子萌發和生長過程中發現，白及種胚通過2種方式形成幼苗，1種方式是種胚萌發后形成淡黃色的球狀體，進一步生長轉變為直徑為幾毫米大小的原球莖，原球莖分化產生芽，最后發育形成幼苗（圖2-g）；另1種方式是淡黃色的球狀體伸長成根狀莖后發育成小苗（圖2-h）。

2.2生根培養

將長至2～3 cm的叢生芽轉入生根誘導培養基中，由于加入了誘導根分化的NAA，約40 d即可培養出3～5條幼根，基部都有白色細密的叢生毛出現（圖3）。在生根的同時幼苗快速生長，株高明顯增加，葉片增多且葉色加深，培養基質被快速消耗。

2.3組培苗的移栽

白及苗移栽前要進行煉苗，在光照培養箱中打開培養盒蓋，蓋上封瓶膜煉苗2 d，移至室溫下繼續煉苗5 d，取出小苗，洗凈根部培養基，移栽至栽培基質中（圖4-a）。栽培基質按m腐殖土 ∶m蛭石=1 ∶1進行配制，使用前消毒，移栽結束后注意保水保濕。白及苗冬天地上部分枯萎，第2年春天在原球莖基礎上長出新芽（圖4-b）。

3結論與討論

利用種子組培快繁技術，通過蒴果消毒、無菌播種、叢生芽誘導、生根誘導和煉苗移栽等環節在實驗室條件下能獲得大量白及實生苗，整個過程均在各環境因子可控條件下完成，但要將組培實生苗用于大田生產，尚須煉苗移栽培育成種苗后定植于大田，通過試驗雖然成功獲得了白及種苗，但由于受本地氣候不適宜白及生長的限制，并沒有進行大田栽培實踐，而且目前也很少有用白及組織培養技術迅速推廣應用的相關報道（僅孟彪等通過誘導原塊莖獲得組培苗而非實生苗進行生產試驗，結果無塊莖的白及組培苗不能成活，且組培苗質量優劣與其塊莖大小密切相關，塊莖越大，成活率越高[8]），因此，組培實生苗的大田定植是制約其推廣的關鍵環節。

試驗中發現白及種胚可通過原球莖和根莖2種途徑形成幼苗，2種幼苗在后期的生產性能以及塊莖品質均有待深入研究。試驗中從無菌播種到大量產生叢生芽時間較長，需近3個月時間，由于培養基主要提供白及種子萌發所需養分，不同植物激素及其濃度促進生長發育進程，因此培養基中營養物質和激素的含量及其種類對種胚的無菌萌發和叢生芽的分化具有非常大的影響，是組培快繁技術的關鍵。培養基物理狀態對白及生長發育也有影響，采用液體培養基或半固體培養基可以縮短萌發時間，但褐化現象較固體培養基嚴重，古碧珠等采用液體培養基誘導同科的蘭花種子時也有類似現象[9]。盡管白及種子萌芽和生長發育是復雜的生理過程，與其遺傳特性有關，但與所處營養條件、外源激素、生態因子等的誘導密切相關。筆者觀察了在一定條件下白及的生長發育過程，而關于其生長發育進程的植物激素調控和生長條件掌控等方面仍需進一步深入研究。

組培實生苗技術的突破能有效解決白及的資源問題，但針對當前白及人工栽培中存在的生產技術落后、管理粗放、育種滯后、種質創新不足、資源破壞嚴重等問題，應加強白及優良品種選育，并系統開展規范化種植及野生資源撫育更新研究，從而推動其生產可持續健康發展，更好滿足市場需求。

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