H BsA g抑制漿樣樹突細胞分泌IF Nα和IL-12

魏萬清 江紅 楊長青 臧國慶 李丹

H BsA g抑制漿樣樹突細胞分泌IF Nα和IL-12

魏萬清 江紅 楊長青 臧國慶 李丹

目的 體外研究H BsA g對漿樣樹突細胞（pD C）功能的影響。方法 磁珠分離健康人外周血pD C，CpG O D N刺激成熟，再給予H BsA g刺激，E LIS A法檢測培養上清中IF Nα和IL-12水平，流式細胞術檢測pD C的表面C D40、C D80、C D83和C D86抗原，激光共聚焦顯微鏡檢測pD C內H BsA g的存在情況。結果 實驗所需的pD C細胞純度≥95%。CpG-O D N2216刺激后，pD C表面C D40、C D80、C D83和C D86抗原的表達水平分別為78.67±2.04、83.63±3.23、71.82±2.91、70.52±2.22，培養上清中IF Nα和IL-12水平顯著高于對照組。上述效應在加入H BsA g后被顯著抑制。激光共聚焦顯微鏡顯示在pD C細胞核周圍有H BsA g存在。結論 H BsA g抑制pD C的成熟和分泌功能。這種作用可能是通過pD C對H BsA g的內吞實現。

乙型肝炎病毒表面抗原；漿樣樹突細胞

H B V感染的控制、轉歸及病毒清除，主要取決于宿主的免疫狀態。研究發現，機體對H B V的耐受狀態并不是因為淋巴細胞功能缺陷，而是由于抗原提呈細胞功能缺陷，特別是樹突狀細胞（dendritic cell，D C）功能缺陷引起，而造成抗原遞呈功能障礙的原因是外界刺激不能誘導D C成熟，H B V本身或者H B V編碼的病毒蛋白都有可能影響抗原提呈細胞成熟［1-2］。

根據表型和功能的差別，外周血D C分為2個亞群，髓樣D C（m D C）和漿樣D C（pD C）兩類。m D C主要發揮抗原提呈作用，并分泌IL-12，誘導T h0細胞分化為T h1細胞，后者產生T h1型細胞因子介導細胞免疫應答。pD C是體內產生IF Nα的最主要細胞。越來越多的證據表明，pD C的數量和功能狀態與疾病的發生和預后密切相關。

H BsA g大量存在于慢性乙型肝炎患者的肝臟以及血液中，在一些患者體內可高達100μg/m L，含量遠遠超過了感染性病毒顆粒［3］，提示其可能在H B V拮抗宿主的免疫反應中發揮重要的作用。本研究擬體外證實H BsA g對pD C功能的影響。

材料和方法

一、pD C的分離、鑒定及培養

抽取健康人外周血400 m L，用淋巴細胞分離液得到PB M C。應用美天旎公司的pD C磁珠分選系統，進行細胞分選；將得到的細胞進行C D123-P E及B D C A-2-FIT C抗體（B D Bioscience）標記，應用流式細胞儀進行陽性細胞鑒定，證實分選得到的pD C陽性細胞純度≥95%。將分選得到的pD C分為4組，即Cp G O D N2216+H BsA g組、Cp G O D N2216組、H BsA g組和PBS組。將各組細胞在體外培養48 h。所有實驗重復3次，每組實驗設3個復孔。

二、流式細胞術檢測pD C的表面抗原

收集、洗滌并重懸4組培養細胞，用流式細胞儀檢測C D40、C D80、C D83和C D86的表達情況。

三、pD C培養上清液中IF N α和IL-12的檢測

收集4組細胞的培養上清液，應用E LIS A法，檢測IF Nα（Invitrogen）和IL-12（R&D System）的表達。

四、pD C內吞H BsA g檢測

收集4組細胞，加入0.05%TritonX-100，再加入H BsA g一抗及熒光標記的二抗及核染料D A PI，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

五、統計學分析

結 果

一、流式細胞儀檢測pD C的分離純度

只有得到高純度的pD C細胞，才使得后續實驗順利進行。結果如圖1所示，分選得到的pD C陽性細胞純度≥95%。

二、H BsA g抑制pD C活性分子表達及細胞因子分泌

流式細胞儀檢測，新鮮分離的pD C幾乎不表達C D40、C D80、C D83和C D86等4種細胞表面抗原。Cp G-O D N2216組中的4種抗原表達百分比顯著增加，與其他3組比較，差異有統計學意義；Cp GO D N2216+H BsA g組中的4種抗原表達百分比，顯著低于C P G組。見表1。Cp G-O D N2216刺激pD C分泌細胞因子，這種刺激作用被H BsA g顯著抑制。見圖2。

三、pD C內吞H BsA g

如圖3所示，pD C細胞核周圍有綠色熒光標記的H BsA g，提示pD C內吞H BsA g。

討 論

pD Cs是體內產生IF Nα的最主要細胞，其分泌的IF N α占PB M C分泌總量的95%以上［4-5］。一旦發生病毒感染，pD C在受感染部位大量積聚，發揮強大的抗病毒作用［6-8］。H B V感染時，亦能見到pD C在肝臟的積聚［9］。國內外諸多研究小組關注D C的生理功能在慢性乙型肝炎（C H B）狀態下發生的改變。目前對C H B患者外周血中D C亞群的頻數是否改變還存在爭議，但一致認為D C亞群的功能在C H B狀態下受損［10-12］。C H B患者外周血m D C頻數與血清A L T水平、病毒載量呈負相關［13］；經L A M抗病毒治療后，pD C數量回升［14］。

H B V感染如何導致D C功能受損機制并不甚清楚。一些病毒，如HIV［15］、H C V［16］等，能夠通過自身結構蛋白抑制pD C的功能來發揮拮抗宿主免疫清除效應。研究發現，單核細胞源性的D C能攝取H B V抗原，但不支持H B V進入細胞核，提示H B V不能在D C內復制，H B V蛋白可能是干擾D C功能的因素［17］。m D C能夠吞噬H BsA g，在m D C成熟過程中如果存在H BsA g或者完整病毒顆粒導致m D C表面共刺激分子的表達降低，不能有效地刺激T淋巴細胞的增殖和分泌細胞因子，這些結果表明H B V完整病毒顆?；騂 BsA g具有免疫調節能力，可以直接導致慢性H B V感染的患者m D C功能失調［18］。這些研究結果提示，C H B患者D C的功能受損并不依賴于H B V復制，而可能與H B V的結構蛋白相關。進一步研究顯示，盡管H BcA g的免疫原性最強，但在機體內主要是通過B細胞而非D C進行抗原提呈［19-20］；且D C不能攝取外源性H BcA g，在機體內是以H BcA g/抗-H Bc免疫復合體的形式被D C提呈［20］。研究還發現，盡管H BcA g、不同截斷體H BcA g及H BeA g能夠在體外刺激H E K293細胞上的T L R信號通路，但H Bc/ H BeA g蛋白不是人T L R的配體，不能激活人T L R信號通路［20］。

本研究顯示，H BsA g存在條件下，pD C表面分子表達減弱，分泌IF N α和IL-12水平降低。IL-12能幫助C T L清除受感染的肝細胞，并且上調IF Nα水平。Cp G-O D N2216刺激pD C分泌IF N α和IL-12的效應能被H BsA g抑制，提示H BsA g干擾pD C免疫功能。這種作用可能是通過pD C對H BsA g的內吞實現。H BsA g抑制pD C功能的具體機制有待進一步研究。

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H BsAg inhibits secretion of interferon-α and interleukin-12 from plasmacytoid dendritic cells

W EI W an-qing，JIA N G H ong，Y A N G Chang-qing，Z A N G Guo-qing，LI D an. Department ofDigestion，Tongji H ospital of Shanghai，Shanghai200065，China

Objective To investigate the effect of H BsA g on function of plasmacytoid dendritic cells（pD C）in vitro.M ethods pD Cs，sorted by im m uno magnetic beads，were divided into four groups：control group（incubated with PBS），H BsA g group（stim ulated by H BsA g），CpG-O D N group（stim ulated by CpG-O D N2216）and CpG-O D N/H BsA g group（stim ulated by CpG-O D N2216 and H BsA g）.Cytokines in the cell supernatant were measured by enzy me-linked im m une sorbent assay.Surface markers were analyzed by flow cyto metry，and endocytosis of H BsA g into cytoplasma of pD Cs was imaged by confocal microscope.Results The purity of pD Cs was m ore than 95%.The freshly isolated pD Cs expressed very low levels of cell surface markers（C D40，C D80，C D83，C D86），w hich was upregulated by CpGO D N2216 but dow nregulated by H BsA g.Activated pD Cs stim ulated by CpG-O D N2216 secreted high levels ofinterferon alpha and interleukin 6，w hich could be inhibited by H BsA g.In im m unofluorescence pictures，Green H BsA g was localized in pD Cs cytoplasm and accu m ulated around cell nucleus.Conclusion H BsA g causes the defects of pD Cs im m une functions，w hich might be achieved through the endocytosis of H BsA g by pD Cs.

H epatitis B surface antigen；Plasmacytoid dendritic cells

2014-10-24）

（本文編輯：錢燕）

國家自然科學基金資助項目（81102279）

200001 上海市同濟醫院消化內科（魏萬清，楊長青）；上海交通大學附屬第六人民醫院感染科（江紅，臧國慶，李丹）